Luận án tiến sĩ: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sợi Actinobacteria từ hải miên vùng biển Hà Tiên - Trường Đại học Cần Thơ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TRẦN VŨ PHƯƠNG PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN SỢI (ACTINOBACTERIA) TỪ HẢI MIÊN VÙNG BIỂN HÀ TIÊN VÀ XÁC ĐỊNH HỢP CHẤT SINH HỌC KHÁNG VI SINH VẬT GÂY BỆNH LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ 62420201 NĂM 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TRẦN VŨ PHƯƠNG PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN SỢI (ACTINOBACTERIA) TỪ HẢI MIÊN VÙNG BIỂN HÀ TIÊN VÀ XÁC ĐỊNH HỢP CHẤT SINH HỌC KHÁNG VI SINH VẬT GÂY BỆNH LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ 62420201 NGƯỜI HƯỚNG DẪN GS. CAO NGỌC ĐIỆP PGS. NGÔ THỊ PHƯƠNG DUNG NĂM 2022 CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG Luận án này với tựa đề là “Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sợi (A ctinobacteria) từ hải miên vùng biển Hà Tiên và xác định hợp chất sinh học kháng vi sinh vật gây bệnh” do nghiên cứu sinh Trần Vũ Phương thực hiện theo sự hướng dẫn của GS. Cao Ngọc Điệp và PGS.TS Ngô Thị Phương Dung.

Luận án đã được báo cáo và được Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ thông qua ngày: …/…/2022. Luận án đã được chỉnh sửa theo góp ý và được Hội đồng đánh giá luận án xem lại. Thư ký Ủy viên Ủy viên Phản biện 1 Phản biện 2 Phản biện 3 Người hướng dẫn chính Người hướng dẫn phụ Chủ tịch Hội đồng GS. Cao Ngọc Điệp PGS.

Ngô Thị Phương Dung i LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi nhận được rất nhiều sự hỗ trợ từ Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học, Khoa Sau Đại học, nhiều Thầy, Cô, đồng nghiệp, các học viên và sinh viên. Tôi xin chân thành tri ân sâu sắc đến GS. Cao Ngọc Điệp và PGS. Ngô Thị Phương Dung , đã tận tình hướng dẫn khoa học, tư vấn thiết kế các thí nghiệm, hướng dẫn cách tiếp cận các kiến thức khoa học trong lĩnh vực nghiên cứu, từ đó giúp tôi hoàn thành luận án.

Chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học, Khoa Sau Đại học, quý đồng nghiệp đã tạo điều k iện tốt nhất cho tôi hoàn thành nhiệm vụ học tập và nghiên cứu. Chân thành cảm ơn quý thầy cô tham gia đào tạo chương trình nghiên cứu sinh ngành công nghệ sinh học của Trường Đại học Cần Thơ đã tận tình truyền đạt kiến thức, giúp đỡ, động viên và tạo điều kiện thuận lợi tốt nhất cho tôi hoàn thành nhiệm vụ học tập và nghiên cứu. Chân thành cảm ơn các cán bộ Phòng thí nghiệm của Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, Phòng thí nghiệm hóa, Khoa Khoa học Tự nhi ên các học viên cao học và các em sinh viên đã nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ cho tôi hoàn thành luận án này. Sau cùng xin được gửi lời cảm ơn đến những người thân yêu trong gia đình luôn đồng hành, động viên, giúp tôi vượt qua khó kh ăn và hoàn thành quá trình học tập, nghiên cứu.

Trân trọng cảm ơn. Nghiên cứu sinh Trần Vũ Phương ii TÓM TẮT Đề tài “ Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sợi (VKS) (Actinobacteria) từ hải miên ở vùng biển Hà Tiên và xác định hợp chất sinh học kháng vi khuẩn gây bệnh ” được thực hiện nhằm phân lập, tuyển chọn được những dòng VKS từ hải miên có khả năng sản xuất các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn tốt. Kết quả nghiên cứu của đề tài đã phân lập được 198 dòng VKS từ hải miên, trong đó 130/198 dòng có khả năng kháng lại ít nhất một trong năm loài vi sinh vật (VSV) được thử nghiệm. Dựa vào kết quả khả năng kháng VSV gây bệnh của các dòng VKS, thứ tự số dòng có khả năng kháng năm loài VSV được thử nghiệm từ cao nhất đến thấp nhất được xác định như sau: Bacillus cereus (82 dòng, Salmonella typhimurium (73 dòng,), Candida albicans (42 dòng), Escherichia coli (39 dòng) và Staphylococcus aureus (22 dòng).

Hai mươi ba dòng VKS có khả năng kháng ít nhất hai loại VSV thử nghiệm và mức độ kháng từ trung bình đến kháng mạnh, được tuyển chọn và định danh bằng phương pháp giải trình tự đoạn gen. Kết quả cho thấy có bốn họ gồm Actinomycetaceae, Microbacteriaceae, Nocardiaceae và Gordoniaceae. Sự khác biệt về tỷ lệ hiện diện các gen chỉ thị sản xuất các chất có hoạt tính sinh học, bao gồm PKS-I, PKS-II và NRPS, được xác định tương ứng lần lượt như sau: 16/ 23 dòng, 14/23 dòng và 11/23 dòng. Hai dòng VKS có khả năng kháng khuẩn cao nhất, gồm Streptomyces tateyamensis ND1.7a và Microbacterium tumbae ND2.7c, được tuyển chọn để phân tích và xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học.

Bảy hợp chất có hoạt tính sinh học được sản xuất từ S.7a gồm có: thymine, 2 -pentanone-4-hydroxy-4- methyl, cyclohexasiloxane dodecamethyl, cycloheptasiloxane tetradecamethyl, oxime- methoxy-phenyl, hexanedioic acid bis (2-ethylhexyl) ester và diisooctyl phthalate.7c, 11 hợp chất có hoạt tính sinh học được xác định bao gồm: cyclopentasiloxane decamethyl-, tetrasiloxane 3.5-diethoxy-1,1,1,7,7,7-hexamethyl- 3,5-bis(trimethylsiloxy), 1-dodecene, 3-isopropoxy-1,1,1,7,7,7-hexamethyl-3,5,5- tris(trimethylsiloxy) tetrasiloxane, 3,5-di-t-butylphenol, phthalic acid, 3,4- dihydroxymandelic acid 4TMS, 1.6-dioxacyclododecane-7-12-dione, 2-propyl-1- pentanol, 2-(2’,4’,4’,6’,6’,8’,8’-heptamethyltetrasiloxan-2’yloxy)-2,4,4,6,6,8,8,10.10- nonamethylcyclopentasiloxane và phthalic acid monoethyl ester. Các hợp chất phát hiện từ hai dòng VKS này đã được nhiều nhà nghiên cứu công bố có hoạt tính sinh học hữu ích, đặc biệt là khả năng kháng nấm và kháng khuẩn. Các kết quả của đề tài là công trình nghiên cứu đầu tiên về VKS trong hải miên ở vùng biển Hà Tiê n, là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm tìm ra loại dược phẩm mới sản xuất từ các VSV cộng sinh với hải miên góp phần bảo vệ sức khỏe cho con người. Từ khóa: Hải miên, Microbacterium, Streptomyces, vi khuẩn sợi, vùng biển Hà Tiên.

iii ABSTRACT The study “Isolation and selection of actinobacteria from sponges at Ha Tien sea territory and identification of bioactive metabolites against pathogenic bacteria” was carried out with the aim to isolate and select actinobacterial strains from sponges, which have the ability to produce high antibacterial activity compounds. A total of 198 actinobacterial strains was isolated from sponges, of which 130/198 isolates were resistant to at least one of the five tested bacteria. Based on the results of antibacterial activity of the actinobacterial isolates, the strength of resistance to the five bacterial pathogens in a range from the strongest to the lowest were found as follows: Bacillus cereus (82 strains), Salmonella typhimurium (73 strains), Candida albicans (42 strains), Escherichia coli (39 strains), and Staphylococcus aureus (22 strains). The twenty-three actinobacterial isolates against at least two of the five tested bacteria with moderate to high resistance were selected and characterized by the genetic sequencing method.

They were identified to be belonged to four genera: Actinomycetaceae, Microbacteriaceae, Nocardiaceae, and Gordoniaceae. The difference of present rate of genes indicating the production of biologically active substances, including PKS-I, PKS-II, and NRPS, was found as follows: 16/23 strains, 14/23 strains, 11/23 strains; respectively. The two actinobacterial strains having the highest antibacterial ability, Streptomyces tateyamensis ND1.7a and Microbacterium tumbae ND2.7c, were selected for analysis and identification of biologically active compounds. Seven compounds produced from S.7a were found including thymine, 2- Pentanone-4-hydroxy-4-methyl, cyclohexasiloxane dodecamethyl, cycloheptasiloxane tetradecamethyl, oxime- methoxy-phenyl, hexanedioic acid bis (2-ethylhexyl) ester, and diisooctyl phthalate.7c, 11 compounds were determined as follows: cyclopentasiloxane decamethyl-, tetrasiloxane 3.5-diethoxy-1,1,1,7,7,7- hexamethyl-3,5-bis(trimethylsiloxy), 1-dodecene, 3-isopropoxy-1,1,1,7,7,7- hexamethyl -3,5,5-tris(trimethylsiloxy) tetrasiloxane, 3,5-di-t-butylphenol, phthalic acid, 3,4-dihydroxymandelic acid 4TMS, 1.6-dioxacyclododecane-7-12-dione, 2- Propyl-1-pentanol, 2-(2’,4’,4’,6’,6’,8’,8’-heptamethyltetrasiloxan-2’yloxy)- 2,4,4,6,6,8,8,10,10-nonamethylcyclopentasiloxane, and phthalic acid monoethyl ester.

The compounds produced by these two actinobacterial strains were reported by numbers of researchers in the context of their useful biological activities, especially antifungal and antibacterial activities. The result of this study is the first research on actinobacteria in sponges in Ha Tien Sea and it can be used as a basis for further studies, in which to explore the new kinds of medicine produced from symbiotic microorganisms with sponges contributing to protect human health. Keywords: Actinobacteria, Ha Tien Sea, Microbacterium, sponges, Streptomyces. iv LỜI CAM ĐOAN Tôi tên Trần Vũ Phương, là nghiên cứu sinh ngành Công nghệ sinh học khóa 2016.

Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu khoa học thực sự của bản thân tôi được sự hướng dẫn khoa học của GS. Cao Ngọc Điệp và PGS. Ngô Thị Phương Dung. Các thông tin sử dụng tham khảo trong đề tài luận án được thu thập từ các nguồn đáng tin cậy, đã được kiểm chứng, được công bố rộng rãi và được tôi trích dẫn nguồn gốc rõ ràng ở phần Danh mục Tài liệu tham khảo.

Các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án này là do chính tôi thực hiện một cách nghiêm túc, trung thực và không trùng lắp với các đề tài khác đã được công bố trước đây. Tôi lấy danh dự và uy tín của bản thân để đảm bảo cho lời cam đoan này. Người hướng dẫn Nghiên cứu sinh GS. Cao Ngọc Điệp Trần Vũ Phương v MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT…………………………………………….

iv LỜI CAM ĐOAN ………….………………… vi DANH SÁCH BẢNG……………………………. xii DANH SÁCH HÌNH………………………….……………………………… xiii TỪ VIẾT TẮT………………………………………. xvi CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU……………………………….2 Mục tiêu đề tài………………………………………… .1 Mục tiêu tổng quát…………………………… .2 Mục tiêu cụ thể………………………………… .3 Đối tượn g nghiên cứu…………………………………….4 Phạm vi nghiên cứu…………………………… .5 Nội dung nghiên cứu ………………………………….6 Đóng góp mới của luận án…………………………………… .7 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án……….1 Ý nghĩa khoa học……………………………………….2 Ý nghĩa thực tiễn……………………………………….…………… 4 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………….1 Phân loại khoa học và phân bố …………………….2 Đặc điểm cấu tạo…………………….3 Đặc điểm sinh sản, sinh trưởng và phát triển của hải miên ………….1 Sự sinh sản vô tính ………………………… .2 Sự sinh sản hữu tính …………………………………………….4 Đa dạng VSV sống cùng với hải miên ………….1 Vi khuẩn liên kết với hải miên …. Nấm và tảo liên kết với hải miên ……………………………… 10 2.3 VKS liên kết với hải miên ………………………….4 Cổ vi khuẩn (Archaea) liên kết với hải miên ….2 Vi khuẩn sợi (xạ khuẩn) (Actinobacteria) …………….1 Phân bố của VKS trong tự nhiên… ………………….2 Đặc điểm sinh học của VKS………………….3 Sự hình thành của bào tử VKS……………….4 Các phương pháp nuôi cấy để thu nhận kháng sinh ở VKS ……….3 Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ VKS……………….1 Khái quát về các con đường sinh tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học …………………………………………….2 Phân loại các kháng sinh từ VKS ………….3 Những hợp chất có hoạt tính sinh học hình thành từ VKS………….4 Một số nhóm chất có hoạt tính kháng khuẩn tiêu biểu từ VKS Streptomyces sp.

có nguồn gốc từ biển.4 Một số VSV gây bệnh……………………………….1 Vi khuẩn Bacillus cereus……………….2 Vi khuẩn Staphylococcus aureus ……………….3 Vi khuẩn Escherichia coli………………….4 Vi khuẩn Salmonella……………………….5 Nấm Candida albicans………………………….5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước………………….………… 46 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …………………………… 49 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ………………….2 Phương tiện nghiên cứu .1 Nguyên vật liệu…………………………….2 Thiết bị - dụng cụ.3 Hóa chất - môi trường ……………… …………….3 Phương pháp nghiên cứu………………………………….1 Thu thập và xử lý mẫu………………………………….2 Phân lập và nuôi cấy VKS……………………….1 Mục tiêu thí nghiệm…………………………….2 Sơ đồ quy trìn h phân lập VKS từ hải miên.3 Các bước tiến hành thí nghiệm………………………………… 52 3.