Phân lập & tuyển chọn Pseudomonas cố định đạm lúa ĐBSCL - Ngô Thanh Phong, ĐH Cần Thơ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGÔ THANH PHONG PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM PSEUDOMONAS SPP. BÓN CHO CÂY LÚA CAO SẢN VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành VI SINH VẬT HỌC Mã số 62 42 40 01 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học PGS. CAO NGỌC ĐIỆP Cần Thơ - 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGÔ THANH PHONG PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM PSEUDOMONAS SPP. BÓN CHO CÂY LÚA CAO SẢN VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành VI SINH VẬT HỌC Mã số 62 42 40 01 Cần Thơ - 2012 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc ------------------------------------ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn cố định đạm Pseudomonas spp.

bón cho cây lúa cao sản vùng đồng bằng sông Cửu Long” là của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được người khác công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận án Ngô Thanh Phong i LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn Thầy - PGS. Cao Ngọc Điệp, người đã tận tâm hướng dẫn khoa học, tư vấn và giúp tôi tiếp cận các khía cạnh khoa học cho sự thành công của đề tài nghiên cứu sinh.

Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Cần Thơ, Ban lãnh đạo Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Ban chủ nhiệm Khoa Khoa Học Tự Nhiên, Phòng Đào Tạo, Phòng Quản Lý Khoa Học, Khoa Sau Đại Học và các Phòng Ban chức năng khác của Trường Đại Học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi. Chân thành cảm ơn quí Thầy Cô và anh chị đồng nghiệp ở Bộ môn Sinh học, Khoa Khoa Học Tự Nhiên và Viện Nghiên Cứu và Phát triển Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện thuận lợi, hỗ trợ và tư vấn cho tôi trong thời gian học tập cũng như thực hiện luận án này. Trần Thị Xuân Mai đã tư vấn thiết kế cặp mồi chuyên biệt cho Pseudomonas stutzeri A1501; cảm ơn ông Đào Văn Sơn (nông dân ở nông trường Sông Hậu) đã hỗ trợ đất ruộng để triển khai thí nghiệm chủng vi khuẩn cho cây lúa cao sản trồng ngoài đồng; cảm ơn các học viên cao học và các sinh viên đã có sự cộng tác trong thời gian qua. Chân thành cảm ơn Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp cơ sở đã có những ý kiến nhận xét và góp ý giúp cho luận án được hoàn chỉnh hơn trước khi trình phản biện kín và bảo vệ luận án cấp Trường; cảm ơn hai nhà khoa học đã tham gia phản biện kín cho luận án tiến sĩ; xin cảm ơn Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Trường.

Cảm ơn gia đình và những người thân đã chia sẻ, động viên và tạo điều kiện thuận lợi để tôi được an tâm học tập và hoàn thành luận án tiến sĩ. Xin chân thành cảm ơn! Ngô Thanh Phong ii TÓM LƯỢC Đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn cố định đạm Pseudomonas spp. bón cho cây lúa cao sản vùng đồng bằng sông Cửu Long” được thực hiện từ tháng 11 năm 2008 đến tháng 9 năm 2011. Những nội dung của đề tài đã được thực hiện nhằm đạt đến mục tiêu tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn Pseudomonas spp.

có khả năng cố định đạm hữu hiệu với cây lúa cao sản. Kết quả nghiên cứu của đề tài đã đạt được như sau: Phân lập được 150 dòng vi khuẩn cố định đạm từ 130 mẫu đất vùng rễ lúa của 13 tỉnh thành ở đồng bằng sông Cửu Long trên môi trường Pseudomonas Isolation Agar (Difco). Tất cả 150 dòng vi khuẩn đều có khả năng tổng hợp NH4+ trong đó có 86/150 dòng có khả năng tổng hợp NH4+ cao hơn 5 mg/l. Các dòng tổng hợp NH4+ cao được phân tích PCR-16S rRNA với cặp mồi đặc hiệu FGPS4-281bis và FGPS1509’-153 để nhận diện Pseudomonas.

Kết quả có 55/86 dòng vi khuẩn có băng ở vị trí 1500 bp so với thang chuẩn. Tiếp tục phân tích PCR- nifH rRNA với cặp mồi đặc hiệu PolF-115 và PolR-476 để nhận diện Pseudomonas có đoạn gen nifH , đã phát hiện 32/55 dòng vi khuẩn có băng tương ứng 361 bp so với thang chuẩn. Chọn 20 trong số 32 dòng vi khuẩn có đoạn gen nifH để kiểm chứng lại khả năng cố định nitơ và cả 20 dòng vi khuẩn đều biểu hiện hoạt tính của nitrogenase thông qua phương pháp khử acetylene (ARA). Đánh giá hiệu quả của 20 dòng vi khuẩn này lên chiều cao và trọng lượng khô của cây lúa cao sản trồng trong dung dịch khoáng (không sử dụng đạm) trong 20 ngày, đã chọn được 6 dòng vi khuẩn có độ hữu hiệu cao để tiến hành thí nghiệm trên cây lúa cao sản trồng trong chậu ở nhà lưới.

Kết quả thí nghiệm đã xác định được 6 dòng vi khuẩn có khả năng cung cấp 25 – 75% nhu cầu đạm sinh học cho sự phát triển của cây lúa trồng trong chậu. Chọn 11 dòng vi khuẩn hữu hiệu nhất (bao gồm 6 dòng hiệu quả với cây lúa trồng trong chậu và 5 dòng khác cũng có triển vọng cố định đạm cao) để tiến hành định danh. Sử dụng cặp mồi PST3422-5 và PST3422-580 (được thiết kế nhận diện gen nifH của Pseudomonas stutzeri A1501), đã phát hiện 4/11 dòng có băng tương ứng 575 bp và tương đồng với băng của dòng vi khuẩn đối chứng là Pseudomonas stutzeri A1501 trong phổ điện di của các sản phẩm PCR. Kết quả giải trình tự DNA và so sánh với ngân hàng dữ liệu NCBI cho thấy cả 4 dòng này đều tương đồng di truyền 98-99% iii so với Pseudomonas stutzeri.

Trong đó, hai dòng AG9 và BT2 tương đồng 99%, hai dòng TG1 và BT1 tương đồng 98% với dòng CP000304.1 Pseudomonas stutzeri A1501 và dòng CP002881.1 Pseudomonas stutzeri ATCC 17588. DNA của 7/11 dòng vi khuẩn còn lại được tiếp tục giải trình tự (theo sản phẩm PCR dựa trên cặp mồi FGPS4-281bis và FGPS1509’-153 tương ứng với đoạn 16S rRNA của Pseudomonas) và so sánh với các dòng có trong ngân hàng dữ liệu NCBI. Kết quả cho thấy cả 7 dòng này đều tương đồng di truyền 97-100% so với các loài thuộc giống Burkholderia. Trong đó, dòng CT1 tương đồng 100% với dòng AB568313.1 Burkholderia vietnamiensis 16S-rRNA, dòng VL2 tương đồng 99% với FJ436055.1 Burkholderia vietnamiensis dòng SYe-6586, dòng KG14 tương đồng 99% với DQ979871.1 Burkholderia vietnamiensis dòng AU0829, dòng VL8 tương đồng 98% với EF158393.1 Burkholderia vietnamiensis dòng TVV75, dòng KG1 tương đồng 98% với DQ979872.1 Burkholderia vietnamiensis dòng AU0913, dòng CM1 và KG8 cùng tương đồng 97% với AY098590.1 Burkholderia kururiensis dòng KP23 (dòng KG8 cũng tương đồng 97% với AY098588.1 Burkholderia brasilensis dòng M113) có trong ngân hàng dữ liệu NCBI.

Thí nghiệm ngoài đồng được thực hiện để đánh giá khả năng cố định đạm của 4 dòng vi khuẩn P. vietnamiensis BV3 (KG1) và B. vietnamiensis BV5 (CT1) (được chọn lọc từ 6 dòng vi khuẩn đã thí nghiệm trong nhà lưới) trên cây lúa cao sản (OM2517) trồng trên đất phù sa tại nông trường Sông Hậu – Cần Thơ vào vụ Hè Thu 2011. Kết quả cho thấy từng dòng vi khuẩn P.

stutzeri PS4 và B. vietnamiensis BV3 đều cung cấp đến 50% đạm sinh học trong khi dòng P. stutzeri PS1 và B. vietnamiensis BV5 chỉ cung cấp được 25% nhu cầu đạm sinh học cho sự phát triển của cây lúa cao sản.

Từ khóa: Burkholderia vietnamiensis, cố định đạm sinh học, đất phù sa, đất vùng rễ, gen nif, lúa cao sản, Pseudomonas stutzeri iv SUMMARY Thesis "Isolation and selection of nitrogen-fixing bacteria Pseudomonas spp., it’s application on high-yielding rice cultivated on the alluvial soil of the Mekong Delta" was done from November 2008 to September 2011. The aim of this study was isolation and selection Pseudomonas spp. strains with the high biological nitrogen fixation (BNF) ability to apply to high-yielding rice cultivated on the soil of the Mekong Delta. The results achieved as follows: One hundred and fifty isolates were isolated from 130 soil samples (rice rhizosphere soils of 13 provinces in Mekong Delta).

All of them were able to synthesize NH4+, 86/150 isolates synthesized NH4+ higher than 5 mg/l. The effective isolates (high NH4+ biosynthesis) were analysed by PCR-16S rRNA technique with primers FGPS4-281bis and FGPS1509'-153 to identify Pseudomonas spp. The results showed that 55/86 isolates having band at 1500 bp in comparision to standard ladder; 32/55 isolates were determined nifH gene with PCR technique with specific primer PolF-115 and PolR-476 which had band at 361 bp in electrophoresis gel. Twenty isolates in 32 isolates had high nitrogenase activity through ARA method.

Screening of 20 isolates by evaluation of 20 isolates’s effectiveness on rice cultivated mineral solution free N in 20 days (in-vitro), the results showed that six isolates having high BNF ability manifested on height and dry weight of high-yielding rice. With in-pots experiment, these six isolates provided 25 to 75% nitrogen requirement in the rice growth. Using primer PST3422-5 and PST3422-580 in PCR technique identified 4/11 isolates having band 575 bp together with reference strain (P. stutzeri A1501) in electrophoresis.

Isolates were sequenced, DNA sequencing were compared with GenBank database of NCBI by BLAST N software; the results showed that four isolates were similarity of 98-99% with P. stutzeri, such as AG9 and BT2 strains were similarity of 99%, TG1 and BT1 strains were similarity of 98% with both strains CP000304.1 Pseudomonas stutzeri A1501 and CP002881.1 Pseudomonas stutzeri ATCC 17588. Besides that, seven isolates were further sequenced with DNA from PCR-16S rRNA products, the results showed that all of them were 97-100% similarity v with species of the genus Burkholderia, such as CT1 strain was similarity of 100% with AB568313.1 Burkholderia vietnamiensis 16S-rRNA, VL2 strain was similarity of 99% with FJ436055.1 Burkholderia vietnamiensis strain SYe-6586, KG14 strain was similarity of 99% with DQ979871.1 Burkholderia vietnamiensis strain AU0829, VL8 strain was similarity of 98% with EF158393.1 Burkholderia vietnamiensis strain TVV75, KG1 strain was similarity of 98% with DQ979872.1 Burkholderia vietnamiensis strain AU0913, two strains CM1 and KG8 strain were similarity of 97% with AY098590.1 Burkholderia kururiensis strain KP23 (in which one isolates the identity 97% with AY098588.1 Burkholderia brasilensis strain M113) in the GenBank database of NCBI. A field experiment was conducted to evaluate biological nitrogen fixation ability of four isolates (P.

vietnamiensis BV3 and B. vietnamiensis BV5 and they were selected from in-vitro and in-pots experiments) on high-yielding rice (OM2517) cultivated on alluvial soil of Song Hau farm, Can Tho city in Summer-Autumn cropping-season 2011. The results showed that PS4 strain and/or BV3 strain had biological nitrogen fixation ability equivalent to 50% inorganic fertilizer while two strains (PS1 and/or BV5) only provided 25% nitrogen requirement for rice growth. Keywords: alluvial soil, biological nitrogen fixation, Burkholderia vietnamiensis, high-yielding rice, nif gene, Pseudomonas stutzeri, rhizosphere soil vi MỤC LỤC Trang Lời cam đoan.

vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT. xi DANH SÁCH BẢNG. xii DANH SÁCH HÌNH. xiii CHƢƠNG I: MỞ ĐẦU – TỔNG QUAN ĐỀ TÀI.

Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu .