Phân tích Fluoroquinolon (FQL) trong huyết tương và nước tiểu bằng HPLC và Huỳnh quang

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ Hình 1. Cấu trúc hóa học của MOXI. Cấu trúc hóa học của LEVO. Cấu trúc hóa học của NOR.

Cấu trúc hóa học của CIP. Cân bằng acid base của quinolon. Cân bằng acid base của các fluorroquinolon. FQL tương ứng (1)-LOM; (2)-FLE; (3)-CIP; (4)-NOR.

Phổ hấp th UV của MOXI. Sắc ký đồ khảo sát thành phần dung môi pha động khi định lượng MOXI. Kết quả khảo ảnh hưởng của tỷ lệ pha động đến diện tích pic của MOXI. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH dung dịch đệm phosphat đến diện tích pic MOXI.

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đệm đến diện tích pic MOXI. Sắc ký đồ khảo sát tốc độ dòng pha động. Quy trình xử lý mẫu huyết tương chứa MOXI sau khi đã tối ưu hóa xử lý mẫu. Sắc ký đồ MOXI trong mẫu huyết tương người tại nồng độ 3,0 µg/mL.

Sắc ký đồ của MOXI (a) mẫu trắng, (b) mẫu huyết tương tự tạo với nồng độ MOXI 10,0 µg/mL. Đường chuẩn khi định lượng MOXI trong huyết tương bằng phương pháp HPLC. Sắc ký đồ của MOXI trong mẫu huyết tương người bệnh sử d ng thuốc tiêm truyền Avelox. Phổ UV-VIS(a) và phổ phát xạ (b) của dung dịch Eu3+, MOXI, Eu3+- MOXI, Eu3+-MOXI-SBDS.

Đồ thị cường độ huỳnh quang thay đổi theo thời gian phản ứng. Cường độ phát xạ huỳnh quang của phức Eu(III)-MOXI-SBDS tại các giá trị pH khác nhau. Cường độ phát xạ huỳnh quang của phức Eu(III)-MOXI-SBDS theo nồng độ Eu(III)+. Cường độ phát xạ huỳnh quang của phức Eu(III)-MOXI-SBDS theo nồng độ SBDS.

Điều kiện phân tích MOXI bằng phương pháp phổ huỳnh quang. Phổ huỳnh quang của mẫu trắng và mẫu trắng thêm chuẩn MOXI. Đường biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ MOXI và cường độ huỳnh quang. Phổ huỳnh quang của các dung dịch xây dựng khoảng tuyến tính.

Đường chuẩn xác định hàm lượng MOXI trong huyết tương. (a) Phổ phát xạ (em= 515 nm) và (b) phổ kích thích (ex = 295nm) của LEVO/MOXI tại nồng độ 1,0 µg/ml. Sắc ký đồ của bốn FQL tương ứng với các hệ dung môi pha động khác nhau (trú thích trên sắc ký đồ). Sắc ký đồ của 4 FQL tương ứng với dung môi pha động MeOH:H2O (H3PO4 0,025M) (35:65).

Ảnh hưởng của nồng độ MeOH trong pha động đến thời gian lưu và khả năng tách của các FQL .25 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của chương trình gradient nồng độ MeOH đến sự tách các FQL. Sắc ký đồ tách đồng thời 4 FQN tương ứng với pha động đã tối ưu tại bước sóng kích kích và phát xạ 290/500nm. Ảnh hưởng của bước sóng kích thích (270-300nm) đến diện tích pic của các FQL tại bước sóng phát xạ tại 515 nm. Ảnh hưởng của bước sóng kích thích (270-300nm) đến diện tích pic của các FQL tại bước sóng phát xạ tại 480 nm.

Ảnh hưởng của bước sóng phát xạ (430-515nm) đến diện tích pic NOR và CIP tại bước sóng kích thích 280 nm. Ảnh hưởng của bước sóng phát xạ đến diện tích pic các FQL tại bước sóng kích thích 290 nm. Sắc ký đồ mẫu FQL chuẩn ở hai bước sóng kích thích và phát xạ tương ứng Ex/Em 290/500nm (LEVO/MOXI) và 280/445nm (NOR/CIP) tại nồng độ 1,0 µg/mL75 Hình 3. Sắc ký đồ mẫu trắng (a) và mẫu huyết tương tự tạo chứa FQL nồng độ 1,0 µg/ml kết tủa bằng MeOH (b), TCA 20% (c).

Sơ đồ quy trình xử lý mẫu huyết tương bằng dung môi kết tủa protein - MeOH. Quy trình xử lý mẫu huyết tương bằng dung môi kết tủa protein – TCA 20%. Sắc ký đồ a) Mẫu huyết tương trắng, b) Mẫu huyêt tương thêm chuẩn FQL nồng độ 1,0 µg/ml. Đường chuẩn xác định hàm lượng FQL trong huyết tương.

Sắc ký đồ mẫu trắng (a), mẫu chứa FQL chuẩn nồng độ 1,0 µg/ml (b). Kết quả khảo sát dùng môi chiết. Sơ đồ quy trình định lượng FQL trong nước tiểu – xử lý mẫu bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng. Sơ đồ quy trình định lượng FQL trong nước tiểu – xử lý mẫu bằng phương pháp chiết pha rắn.

Sắc ký đồ mẫu nước tiểu (a) không chứa FQL, (b) mẫu nước tiểu chứa FQL nồng độ 1,0 µg/ml - xử lý mẫu bằng phương pháp chiết lỏng- lỏng. Đường chuẩn xác định của bốn FQL trong nước tiểu – xử lý mẫu bằng chiết lỏng–lỏng. Mẫu nước tiểu không chứa FQL (a), mẫu nước tiểu chứa FQL nồng độ 1,0 µg/ml (b)- xử lý mẫu bằng phương pháp chiết pha rắn. Đường chuẩn xác định của bốn FQL trong nước tiểu – xử lý mẫu bằng chiết pha rắn.

96 xiii MỞ ĐẦU Fluoroquinolon (FQL) là nhóm thuốc kháng sinh tổng hợp có hiệu lực kháng khuẩn mạnh, phổ rộng, chống lại nhiều vi sinh vật gây bệnh nguy hiểm. Chúng có tác d ng tốt với nhiều bệnh nhiễm khuẩn như: nhiễm trùng đường tiết niệu, đường tiêu hóa, hô hấp, tình d c, da và mô mềm [1], [2]. Các kháng sinh này được sử d ng phổ biến nhất trong điều trị nhiễm trùng đường tiết niệu, viêm tuyến tiền liệt, nhiễm trùng da, xương, nhiễm trùng đường ruột do vi khuẩn và các bệnh do các chủng vi sinh vật đã kháng penicillin và macrolid, dự phòng trong bệnh bạch cầu trung tính [1], [2]. Tác d ng kháng khuẩn của nhóm kháng sinh này do ức chế ADN gyrase, ngăn cản sự tổng hợp ADN của vi khuẩn.

Ngoài ra, chúng còn tác d ng cả trên mARN nên ức chế tổng hợp protein vi khuẩn. Do cơ chế ức chế tổng hợp acid nucleic, nhóm kháng sinh này được cho là cơ nguy cơ gây đột biến gen, gây sẩy thai cho người và động vật mang thai khi sử d ng [3]. Các FQL được sử d ng phổ biến trong điều trị nhiễm trùng đường tiết niệu tại Hòa Kỳ và Châu Âu là ciproflxacin, levofloxacin, moxifloxacin và norfloxacin [3, 4]. Mức liều sử d ng được quy định đối với từng kháng sinh trên, giúp phân bố thuốc đạt nồng độ tại vị trí nhiễm trùng để thể hiện tác d ng.

Tuy nhiên khi sử d ng liều chuẩn, có thể dẫn tới phơi nhiễm quá mức ở 1 số cá thể, thể hiện nhiều tác d ng không mong muốn làm cho bệnh nhân không tuân thủ hoặc ngừng dùng thuốc. Hoặc, một số bệnh nhân bị thiếu hàm lượng thuốc tại vị trí tác d ng, dẫn đến thất bại trong điều trị. Các yếu tố ảnh hưởng tới nồng độ tối ưu tại đích tác d ng như đặc điểm sinh lý bệnh nhân, vi khuẩn gây bệnh, vị trí nhiễm trùng, dược động học, dược lực học của thuốc [5, 6]. Trong phân tích FQL, nhiều phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các kỹ thuật phát hiện khác nhau đã được áp d ng.

Phổ biến nhất là HPLC ghép nối với detector UV, huỳnh quang (FLD) và khối phổ (MS). Để phân tích các FQL trong các chế phẩm bào chế thường đơn giản, chỉ cần hòa tan dược chất, pha loãng nếu cần sau đó phân tích trên hệ thống HPLC. Đối với các mẫu dịch sinh học như huyết tương, dịch mật, nước tiểu, nước bọt sẽ phức tạp hơn do lẫn nhiều tạp và có nồng độ thấp khó phát hiện. Cần có phương pháp thích hợp để chiết xuất chất phân tích ra khỏi mẫu, đồng thời loại các tạp gây nhiễu [7], [8].

Phương pháp phân tích đồng thời các FQL được xây dựng với ưu điểm dùng một phương pháp, trong cùng một điều kiện có thể áp d ng cho định lượng FQL khác nhau. Tuy nhiên, việc lựa chọn tối ưu các điều kiện cho các FQL khác nhau sẽ gặp khó khăn hơn do tính chất khác nhau của chúng. Việc theo dõi đánh giá dược động học của các kháng sinh FQL sẽ là công c hữu ích để tránh các thất bại trong sử d ng thuốc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn. Do đó, xây dựng các phương pháp phân tích xác định hàm lượng kháng sinh trong dịch sinh học người bệnh là cần thiết.

Các phương pháp được đề xuất phù hợp với điều kiện kỹ thuật sẵn có của các cơ sở y tế, sẽ góp phần ứng d ng thành công trong điều trị bệnh nhiễm khuẩn bằng kháng sinh FQL. Căn cứ trên điều kiện thực tế của các phòng thí nghiệm, kiểm nghiệm, phòng nghiên cứu tại Việt Nam và vai trò của việc phân tích hàm lượng kháng sinh trong dịch sinh học, chúng tôi đã đề xuất và thực hiện đề tài luận án tiến sỹ có tên: “Nghiên cứu 1 phân tích một số kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolon trong mẫu huyết tương và nước tiểu ”. Mục tiêu, đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài. M c tiêu: nghiên cứu cơ bản nhằm phát triển phương pháp phân tích định lượng thuốc kháng sinh fluoroquinolon trong nền mẫu dịch sinh học (huyết tương và nước tiểu) bằng hai phương pháp khác nhau đó là phương pháp quang phổ huỳnh quang (FLS) và phương pháp sắc ký hỏng hiệu năng cao ghép nối với 2 loại detector (HPLC- PDA và HPLC-FLD).

Đối tượng nghiên cứu: bốn loại kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolon thế hệ 2, 3 và 4 gồm norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin và moxifloxacin trong nền mẫu huyết tương và nước tiểu. Các loại kháng sinh này, trong đó mới nhất là moxifloxacin (thế hệ 4), đang được sử d ng phổ biến trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn nặng đến rất nặng. Phạm vi nghiên cứu: khảo sát xây dựng và đánh giá các quy trình phân tích đơn kháng sinh (moxifloxacin) trong nền mẫu huyết tương và phân tích đồng thời 4 kháng sinh (norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin và moxifloxacin) trong nền mẫu huyết tương và nước tiểu; áp d ng thử nghiệm các quy trình phân tích đã xây dựng với đơn kháng sinh moxifloxacin trong nền mẫu thử huyết tương. Các kết quả dự kiến đạt được 1) Quy trình xác định hàm lượng moxifloxacin trong huyết tương bằng phương pháp HPLC –PDA.

2) Quy trình xác định hàm lượng moxifloxacin trong huyết tương bằng phương pháp FLS. 3) Quy trình xác định đồng thời bốn fluoroquinolon (norfloxacin, ciprocaxin, levofloxacin, moxifloxaxin) trong nước tiểu và huyết tương bằng phương pháp HPLC-FLD. Nội dung nghiên cứu: Nghiên cứu khảo sát điều kiện phân tích xác định kháng sinh moxifloxacin trên 2 hệ thống: sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối detector PDA (HPLC-PDA) và hệ thống máy quang phổ huỳnh quang phân tử (FLS). Nghiên cứu khảo sát quy trình xử lý mẫu huyết tương, các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi moxifloxacin, lựa chọn điều kiện tối ưu khi xác định moxifloxacin bằng HPLC-PDA.

Nghiên cứu khảo sát điều kiện phân tích xác định đồng thời 4 FQL trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối detector huỳnh quang (HPLC-FLD).