Luận án tiến sĩ: Đa hình gen CYP2C9, CYP2C19, CYP3A5, CYP2D6 ở người Kinh Việt Nam - Vũ Phương Nhung

1 MỞ ĐẦU Các enzyme cytochrome P450 (CYP450) thuộc một họ protein-heme lớn, những enzyme này có vai trò thiết yếu đối với các quá trình chuyển hóa hợp chất nội sinh và ngoại sinh. Ở người, có 57 gen chức năng và 58 gen giả đã được báo cáo, trong đó các CYP450 được phân loại thành 18 họ và 44 phân họ. Hầu hết các gen trong nhóm này đều mang những chức năng sinh học trong chuyển hóa các chất nội sinh như acid mật, eicosanoid và steroid. Tuy nhiên, khoảng 12 enzyme CYP450 thuộc các phân họ CYP1, CYP2 và CYP3 là tham gia chuyển hóa thuốc chính.

Phần lớn các loại thuốc được kê đơn trong lâm sàng được chuyển hóa bởi các enzyme CYP450, ngoài ra cũng có rất nhiều loại thuốc chỉ được chuyển hóa bởi một CYP450 duy nhất. Có thể thấy, những yếu tố nội sinh và ngoại sinh gây ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme của CYP450 đóng vai trò rất quan trọng đến dược động học của các loại thuốc được đưa vào cơ thể. Đối với một số các CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc như CYP2C9, CYP2C19 và CYP2D6, các biến thể di truyền trong các gen mã hóa cho protein có ảnh hưởng nhiều đến sự khác biệt trong hoạt tính của enzyme, trong khi đó đối với những CYP450 khác (CYP1A2, CYP3A4) thì tỉ lệ này không đáng kể. Các gen mã hóa cho các enzyme CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc có tính đa hình rất cao.

Sự đa dạng di truyền này được thể hiện ở những đa hình đơn nucleotide (Single nucleotide polymorphism-SNP) xuất hiện với tần số hiếm (rare) hoặc phổ biến (common), ngoài ra còn có các biến thể số bản sao (Copy number variant-CNV) bao gồm các mất/lặp đoạn. Chức năng của biến thể được phân loại từ không chức năng đến tăng cường chức năng, từ đó mà kiểu hình chuyển hóa được chia thành các cấp độ: chuyển hóa thuốc yếu (Poor Metabolizer-PM), chuyển hóa thuốc trung bình (Intermediate Metabolizer-IM), chuyển hóa thuốc bình thường (Extensive Metabolizer-EM) và chuyển hóa thuốc cực nhanh (Ultrarapid Metaolizer- UM). Những CYP450 tham gia vào chuyển hóa nhiều loại thuốc trên thị trường nhất hiện nay là CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A4/5. Năm gen CYP450 nói trên mã hóa cho các enzyme tham gia vào chuyển hóa 60-80% các loại thuốc thường được kê đơn.

2 Tính cấp thiết của vấn đề nghiên cứu: Sự khác nhau trong đáp ứng thuốc giữa các cá nhân là điều khó tránh khỏi trong điều trị, trong đó có các phản ứng có hại của thuốc (Adverse drugs reaction/ADR). Các ADR là một trong những nguyên nhân chính của các trường hợp bệnh nhân phải nhập viện, một số có thể dẫn tới tử vong. Ingelman-Sunberg và cộng sự đã ước tính ADR làm tiêu tốn khoảng 100 tỉ đô la Mỹ, đây cũng là nguyên nhân dẫn tới 100.000 ca tử vong mỗi năm tại Mỹ. Khoảng 7% các ca nhập viện tại Anh và Thụy Điển cũng có nguyên nhân từ các ADR.

Từ năm 2009, Hiệp hội ứng dụng Di truyền dược học lâm sàng (Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium- CPIC) đã cung cấp các thông tin về việc xét nghiệm di truyền có thể được sử dụng trong tối ưu hóa phác đồ sử dụng thuốc. Đối với một vài loại cặp gen-thuốc, CPIC cũng đã đưa ra những chỉ dẫn về liều dùng cụ thể. Như đã trình bày ở trên, các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 là 4 trong số các gen CYP450 có tính đa hình cao mà các dạng đa hình của chúng khiến cho bệnh nhân có khả năng chuyển hóa từng loại thuốc cụ thể rất khác nhau, từ mạnh tới yếu. Cho tới nay, các hiểu biết về đa dạng di truyền của nhóm gen CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc ở người Việt Nam còn rất hạn chế.

Ngày nay, vai trò của dược lý học di truyền liên quan đến chuyển hóa thuốc và tương tác thuốc trong lâm sàng mang tính cấp bách và rất cần đầu tư nghiên cứu. Hiểu biết về tính đa dạng di truyền của các gen tham gia chuyển hóa thuốc ở người Việt Nam được coi là tiền đề để phát triển lĩnh vực này. Nghiên cứu này tập trung vào việc phát hiện các allele đã biết cũng như xác định cả những allele mới ở người Việt Nam. Do vậy, số liệu thu được từ nghiên cứu sẽ cung cấp những thông tin khoa học về đa dạng di truyền của các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 trên người Việt Nam.

Đây cũng là những tiền đề có ý nghĩa và đóng góp một phần cho sự phát triển của lĩnh vực di truyền dược học và y học cá thể. Mục tiêu nghiên cứu: - Xây dựng cơ sở dữ liê ̣u về đa hình/đô ̣t biế n của 04 gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 ở người Kinh Viê ̣t Nam. - Xác định kiểu gen và tần số các allele của 04 gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 trên người Kinh ở Việt Nam đồ ng thời phân tích và dự đoán chức năng của các biế n thể mới. 3 Cách tiếp cận nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu là 136 người Kinh khỏe mạnh không có quan hệ huyết thống.

Nghiên cứu này sử dụng phương pháp giải trình tự Sanger nhằm xác định tất cả các biến thể nằm trong vùng promoter cùng với tất cả 9 exon và vùng biên của 03 gen CYP2C9, CYP2C19 và CYP2D6. Đối với gen CYP3A5, phương pháp giải trình tự Sanger cũng được áp dụng nhằm xác định các biến thể đã được công bố là có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme bao gồm: *3, *6, *8 và *9. Các CNV của các gen nghiên cứu được xác định bằng phương pháp khuếch đại đa đầu dò phụ thuộc phản ứng ghép nối (Multiplex ligation-dependent probe amplification-MLPA). Những mẫu được xác định là có bất thường số bản sao được kiểm tra lại bằng phương pháp Long range PCR hoặc real-time PCR.

Các biến thể sau khi đã được xác định sẽ tiếp tục được tổng hợp số liệu để tính toán tần số allele cũng như tần số kiểu gen trên tổng số mẫu nghiên cứu đối với mỗi gen. Tiến hành so sánh về tần số và phân bố của các allele của mỗi gen ở quần thể người Kinh Việt Nam so với các quần thể người khác. Bên cạnh đó, những biến thể mới được tiến hành phân tích in silico nhằm dự đoán ảnh hưởng của các biến thể này đến chức năng của protein tương ứng. Những đóng góp mới của luận án: Xác định được một số biến thể mới trong promoter và intron của các gen CYP450, cụ thể: 5 biến thể mới trong in tron của CYP2C9, 3 biến thể mới trong intron của CYP2C19, 3 biến thể mới trong promoter và 2 biến thể mới trong intron của CYP2D6 và 3 biến thể mới thuộc vùng mã hóa của 2 gen CYP2C9 và CYP2D6.

Đã phân tích in silico cho thấy những biến thể này gây ảnh hưởng có hại đến chức năng của protein. Các biến thể CYP2D6*5, CYP2D6*10, CYP2D6*13 và CYP2D6*36-*10 đã được xác định trên người Kinh ở Việt Nam là những biến thể làm giảm hoặc mất hoạt tính của enzyme đã được xác định với tỉ lệ lần lượt là: 8,09%, 43,75%, 1,547% và 12,13%. CYP450 và chuyển hóa thuốc trong gan Thuốc là những chế phẩm có chứa dược chất dùng với mục đích phòng-chữa bệnh hay điều trị giảm nhẹ. Enzyme chuyển hóa thuốc được biết đến nhiều nhất là các enzyme CYP450, đây là những enzyme tham gia vào các quá trình oxi hóa khử và thủy phân.

Mục tiêu chính của quá trình chuyển hóa thuốc đó là giúp đào thải thuốc ra khỏi cơ thể. Ví dụ như các tiền chất (không có hoạt tính dược lý) sau khi được hấp thụ vào cơ thể sẽ được chuyển đổi thành thuốc có hoạt tính. Mặt khác đa số các loại thuốc sau khi chuyển hóa sẽ chuyển sang trạng thái kém hoạt động hơn. Quá trình chuyển hóa thuốc xảy ra ở nhiều cơ quan trong cơ thể như gan, thành ruột, phổi, thận và huyết tương.

Trong số đó, gan là cơ quan chuyển hóa thuốc đầu tiên, đóng vai trò như vị trí thải độc và loại thải các chất ngoại lai bằng cách biến đổi các hợp chất tan trong lipid trở nên ưa nước hơn, quá trình này có sự tham gia của các enzyme. Quá trình chuyển hóa thuốc tại gan trải qua 3 giai đoạn: pha I, pha II và pha III. Trong đó pha I có sự tham gia của các enzyme CYP450, pha II được thực hiện bởi các enzyme vận chuyển acid glucuronic của UDP (UDP-glucuronosyltransferase) (chuyển hóa 40-70% các loại thuốc) và trong pha III thì các enzyme vận chuyển thuốc (drug transporter) sẽ giúp đưa sản phẩm chuyển hóa thuốc tới mật. Klingenberg lần đầu tiên phát hiện ra CYP450 vào năm 1954 trong nghiên cứu về chuyển hóa hoocmon steroid, khi ông trích xuất một loại protein mới từ tế bào gan [1].

Gần một thập kỷ sau, chức năng và tầm quan trọng của CYP450 đã được xác định. Năm 1963, Estabrook và cộng sự đã mô tả vai trò của CYP450 như một chất xúc tác trong quá trình tổng hợp hormone steroid và chuyển hóa thuốc. Cooper và các đồng nghiệp sau đó đã xác nhận CYP450 là một enzyme chủ chốt liên quan đến phản ứng hydroxyl hóa thuốc và steroid [2]. Nhiều protein CYP450 đã được phát hiện rộng khắp cơ thể, chứng tỏ sự tham gia đáng kể vào hoạt hóa hóa học, khử hoạt tính và gây ung thư [3].

Các enzyme CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc pha I là các protein biểu hiện chủ yếu trên mạng lưới nội chất trơn và ti thể của các tế bào gan và biểu mô ruột non (ngoài ra cũng còn ở một số cơ quan khác). Ở người, có 115 gen CYP450 bao gồm 5 cả các gen giả, được đặt tên bắt đầu từ CYP1A1 và kết thúc bởi CYP51P3. Các protein được mã hóa bởi các CYP450 được phân loại dựa trên mức độ tương đồng về trình tự của các amino acid thành các cấp độ từ họ (ví dụ: họ CYP1, CYP2…), phân họ (ví dụ: phân họ CYP1A, CYP2B…) và từng enzyme riêng lẻ (ví dụ: enzyme CYP1A1, CYP2D6…). Trong số các CYP450 biểu hiện trong gan thì CYP3A4 có mức độ biểu hiện mạnh nhất (chiếm 22,1%), tiếp theo là 2 enzyme CYP2E1 (15,3%) và CYP2C9 (14,6%) tính trên tổng số protein trong gan.

Các enzyme CYP450 tham gia xúc tác cho nhiều loại phản ứng như: oxi hóa, oxi hóa sulpho (lưu huỳnh), hydroxyl hóa vòng (nhân) thơm, hydroxy hóa hợp chất không vòng, khử (tách) nhóm N-alkyl, khử (tách) nhóm O-alkyl (alkoxy). Trong số các phản ứng này, phản ứng oxi hóa là phản ứng giúp thêm một nguyên tử oxy vào phân tử thuốc, được biểu diễn bằng phương trình sau: NADPH + H+ + O2 + RH → NADP+ + H2O + ROH Về mặt cấu trúc, CYP450 là những protein có khoảng 400-500 amino acid và chứa một nhóm heme với nguyên tử Fe ở trung tâm. Tất cả các CYP450 đều có chung cấu trúc bảo thủ được tạo nên bởi bốn vòng xoắn D, L, I và E.