Luận án TS: Khảo sát quần thể lympho TCD4 Treg, Th17 ở bệnh nhân HBV mạn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LÊ THỊ THUÝ HẰNG KHẢO SÁT QUẦN THỂ TẾ BÀO LYMPHO TCD4 TREG VÀ TH17 Ở BỆNH NHÂN NHIỄM HBV MẠN LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LÊ THỊ THUÝ HẰNG KHẢO SÁT QUẦN THỂ TẾ BÀO LYMPHO TCD4 TREG VÀ TH17 Ở BỆNH NHÂN NHIỄM HBV MẠN NGÀNH: BỆNH TRUYỀN NHIỄM VÀ CÁC BỆNH NHIỆT ĐỚI MÃ SỐ: 9720109 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS. PHẠM THỊ LỆ HOA TP.

HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023. i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố ở bất kỳ nơi nào. Tác giả luận án Lê Thị Thuý Hằng Lê Thị Thuý Hằng. ii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Danh mục các chữ viết tắt và thuật ngữ Anh-Việt v Danh mục các bảng x Danh mục các hình xii Danh mục các biểu đồ và sơ đồ xiii ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1.1 Tình hình nhiễm HBV trên thế giới và hình thái nhiễm HBV cấp 4 và mạn 1.2 Đặc điểm cấu trúc di truyền của HBV và chu trình HBV trong 5 gan 1.3 Các giai đoạn diễn biến ở người nhiễm HBV mạn theo quan 7 điểm miễn dịch 1.4 Đáp ứng miễn dịch bẩm sinh và thích nghi với nhiễm HBV 11 1.5 Tế bào miễn dịch Treg và Th17 17 1.6 Phương pháp đếm tế bào miễn dịch và đo mức độ biểu hiện yếu 24 tố phiên mã 1.7 Các nghiên cứu đã được thực hiện về tế bào Treg và Th17 ở cá 28 thể nhiễm HBV Chương 2.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Thiết kế nghiên cứu 32 2.2 Đối tượng nghiên cứu 32 2.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 33 2.4 Các nhóm nghiên cứu 33 .5 Các biến số chính của nghiên cứu 34 2.6 Kỹ thuật đo lường biến số, thu thập dữ liệu 36 2.7 Nhập và phân tích dữ liệu 46 2.8 Trình tự tiến hành 46 2.9 Đạo đức trong nghiên cứu 49 Chương 3.1 Đặc điểm dân số nghiên cứu 52 3.2 Đặc điểm tế bào Treg và Th17 của các nhóm nghiên cứu 54 3.3 Các yếu tố phiên mã FOXP3 và RORγt của các nhóm nghiên 63 cứu 3.4 Tương quan giữa tỉ lệ Treg, Th17, mức độ biểu hiện FOXP3 và 69 RORγt với tình trạng HBeAg, HBV DNA, men gan và chức năng gan ở các nhóm nhiễm HBV mạn Chương 4.1 Đặc điểm dân số nghiên cứu 87 4.2 Đặc điểm tế bào Treg và Th17 của các nhóm nghiên cứu 87 4.3 Các yếu tố phiên mã FOXP3 và RORt ở các nhóm nghiên cứu 99 4.4 Tương quan giữa tỉ lệ Treg, Th17, mức độ biểu hiện FOXP3 và 105 RORγt với tình trạng HBeAg, HBV DNA, men gan và chức năng gan ở các nhóm nhiễm HBV mạn. iv KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 116 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN 119 QUAN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC. v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH-VIỆT Từ viết tắt Thuật ngữ tiếng Anh Thuật ngữ tiếng Việt ACLF Acute on chronic liver failure Suy gan cấp trên nền mạn Alb Albumin Albumin ALT Alanine aminotransferase Men gan ALT Anti-HBc Hepatitis B core antibody Kháng thể kháng kháng nguyên lõi HBV Anti-HBe Hepatitis B e antibody Kháng thể kháng kháng nguyên e HBV Anti-HBs Hepatitis B surface antibody Kháng thể kháng kháng nguyên bề mặt HBV APC Allophycocyanin APRI AST to Plalete Ratio Index Tỉ số AST so với tiểu cầu B Hệ số hồi quy chưa chuẩn hoá  Hệ số hồi quy đã chuẩn hoá Bil Bilirubin Bilirubin BP Bùng phát cAMP cyclic adenosine monophosphate cccDNA covalently closed circular DNA DNA vòng đóng đồng hoá trị CD Cluster differentiation cDNA Complementary DNA DNA bổ sung cGAS cyclic GMP AMP Synthase CRP C reactive protein. vi CT Cycle threshold Ngưỡng chu kỳ CTLA Cytotoxic T lymphocyte antigen Kháng nguyên lympho T độc tế bào DNA Deoxyribonucleic acid ∆∆CT Delta delta cycle threshold EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic acid FBS Fetal bovine serum Huyết thanh bào thai bò FOXP3 Forkhead box protein 3 GAPDH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GzB Granzyme B HBcAg Hepatitis B core antigen Kháng nguyên lõi HBV HBeAg Hepatitis B e antigen Kháng nguyên e HBV HBsAg Hepatitis B surface antibody Kháng nguyên bề mặt HBs HBV Hepatitis B virus Vi rút viêm gan B HBV DNA Hepatitis B virus deoxyribonucleic DNA của HBV acid HBVe+ Nhiễm HBV mạn HBeAg dương HBV HBV polymerase/reverse men sao chép ngược HBV Pol/RT transcriptase HBx HBV-encoded X Protein Kháng nguyên biểu mô của HBV HCC Hepatocellular carcinoma Ung thư biểu mô tế bào gan HCV Hepatitis C virus Vi rút viêm gan C HIV Human immunodeficiency virus Vi rút gây suy giảm miễn dịch ở người.

vii HSP Heparin sulfate proteoglycan IFN Interferon IL Interleukin INR International normalized ratio IQR Interquartile range Khoảng tứ phân vị KM Khoẻ mạnh KTC Khoảng tin cậy MAIT Mucosal associated invariant T Tế bào T bất biến liên quan với niêm mạc MELD Model for end stage of liver Mô hình bệnh gan giai đoạn disease cuối MHC Major histocompatibility complex Phức hợp phù hợp mô chính mRNA messenger RNA RNA thông tin NA Not applicable Không áp dụng NAs Nucleoside analogues Các thuốc tương tự nucleos(t)ide NK Natural killer Tế bào giết tự nhiên NTCP Sodium taurocholate cotransporting polypeptide PBS Phosphate buffered saline Dung dịch muối đệm phosphate PD1 Programmed cell death protein 1 PE Phycoerythrin PRF Perforin pTreg peripheral regulatory T cell Tế bào Treg từ ngoại biện. viii qPCR Quantitative polymerase chain Phản ứng chuỗi polymerase reaction định lượng rc DNA relaxed circular DNA DNA vòng duỗi RIG-I Retinoic acid inducible gene I RNA Ribonucleic acid RORγt Retinoic acid related orphan receptor gamma t RT-PCR Reverse transcription polymerase Phản ứng chuỗi polymerase chain reaction sao chép ngược RT-qPCR quantitative Reverse transcription Phản ứng chuỗi polymerase polymerase chain reaction sao chép ngược định lượng SE Standard error Sai số chuẩn STAT Signal tranducer and activator of transcription T CD4+ CD4+ T cell Tế bào lympho T CD4+ T CD8+ CD8+ T cell Tế bào lympho T CD8+ TC Tiểu cầu Tfh T follicular helper cell TGF Transforming growth factor Th T helper cell Tế bào lympho T giúp đỡ Th17 T helper 17 cell Tế bào lympho T giúp đỡ 17 TLR Toll like receptor Thụ thể giống Toll TNF Tumor necrosis factor Yếu tố hoại tử bướu Treg regulatory T cell Tế bào lympho T điều hoà tTreg thymic regulatory T cell Tế bào Treg từ tuyến ức ULN Upper limit of normal Giới hạn trên bình thường. ix VGMe+ Viêm gan B mạn HBeAg dương VIF Variance Inflation Factor Hệ số phóng đại phương sai VS Versus So với YTPM Yếu tố phiên mã. x DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Lượng RNA được sử dụng để tổng hợp cDNA (25 ng/1) 42 phản ứng) Bảng 2.2: Chu trình nhiệt tổng hợp cDNA 43 Bảng 2.3: Trình tự của các mồi sử dụng cho phản ứng PCR định 44 lượng Bảng 2.4: Thành phần trong 1 phản ứng PCR đo mức độ biểu hiện 44 gen của FOXP3 và RORγt Bảng 2.5: Chu trình luân nhiệt trong phản ứng PCR 45 Bảng 3.1: Đặc điểm lúc vào của các nhóm nghiên cứu (n = 159) 52 Bảng 3.2: Đặc điểm lúc vào nghiên cứu của hai nhóm bùng phát (n = 53 61) Bảng 3.3: Tỉ lệ Treg, Th17, Treg tiết IL-17A và tỉ số Treg/Th17 của 55 nhóm khỏe mạnh và nhóm HBV mạn(n = 159) Bảng 3.4: Tỉ lệ Treg, Th17, Treg tiết IL-17A và tỉ số Treg/Th17 của 58 các nhóm nghiên cứu (n = 159) Bảng 3.5: Tỉ lệ Treg, Th17, Treg tiết IL-17A và tỉ số Treg/Th17 của 2 60 nhóm bùng phát nhẹ và nặng (n = 61) Bảng 3.6: Mức độ biểu hiện FOXP3, RORγt và tỉ số FOXP3/RORγt 63 của nhóm khỏe mạnh và nhóm HBV mạn (n = 80) Bảng 3.7: Mức độ biểu hiện FOXP3, RORγt và tỉ số FOXP3/RORγt 65 của các nhóm nghiên cứu (n = 80) Bảng 3.8: Mức độ biểu hiện FOXP3, RORγt và tỉ số FOXP3/RORγt 67 của 2 nhóm bùng phát nhẹ và nặng (n =30) .9: Tương quan giữa tỉ lệ Treg, Th17, mức độ biểu hiện 70 FOXP3, RORγt với HBV DNA, AST và ALT trong toàn dân số nghiên cứu Bảng 3.10: Tương quan giữa tỉ lệ Treg, Th17, mức độ biểu hiện 71 FOXP3, RORγt với HBV DNA, AST và ALT ở nhóm nhiễm HBV mạn HBeAg dương Bảng 3.11: Tương quan giữa tỉ lệ Treg, Th17, mức độ biểu hiện 72 FOXP3, RORγt với HBV DNA, AST và ALT ở nhóm viêm gan B mạn HBeAg dương Bảng 3.12: Tương quan giữa tỉ lệ Treg, Th17, mức độ biểu hiện 74 FOXP3, RORγt với HBV DNA và chức năng gan ở nhóm bùng phát Bảng 3.13: Các yếu tố tương quan với Treg trong toàn dân số: Phân 84 tích đa biến (n = 137) Bàng 3.14: Các yếu tố tương quan với Th17 trong toàn dân số: Phân 84 tích đa biến (n = 137) Bảng 3.15: Các yếu tố tương quan với Treg trong nhóm bùng phát: 85 Phân tích đa biến (n = 61).

xii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1: Cấu trúc tiểu thể Dane và các tiểu phần của HBV 6 Hình 1.2: Các quan niệm về diễn tiến tự nhiên nhiễm HBV mạn theo 8 thời gian Hình 1.3 Quá trình biệt hoá từ tế bào T CD4+ sơ khai thành tế bào 17 Th1, Th2, Treg và Th17 Hình 1.4 Những cơ chế hoạt động của tế bào Treg 19 Hình 1.5 Tế bào Treg tiết IL-17A 21 Hình 1.6: Hình phân bố tế bào T có biểu hiện FOXP3 và IL-17 trên 25 máy đếm tế bào dòng chảy Hình 3.1: Biểu hiện tế bào Treg và Th17 của một người đại diện mỗi 54 nhóm nghiên cứu trên máy đếm tế bào dòng chảy. xiii DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ VÀ SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ 2.1: Mô hình nghiên cứu 36 Sơ đồ 2.2: Lưu đồ tiến hành nghiên cứu 48 Sơ đồ 3.1: Quá trình thực hiện nghiên cứu 50 Biểu đồ 3.1: Tỉ lệ Treg, Th17 và tỉ số Treg/Th17 của các nhóm nghiên 57 cứu (n =159) Biểu đồ 3.2: Tỉ lệ Treg tiết IL-17A của các nhóm nghiên cứu (n =159) 58 Biểu đồ 3.3: Tỉ lệ Treg, Th17 và tỉ số Treg/Th17 của 5 nhóm nghiên 62 cứu (n =159) Biểu đồ 3.4: Tỉ lệ Treg tiết IL-17A của 5 nhóm nghiên cứu (n =159) 63 Biểu đồ 3.5: Mức độ biểu hiện FOXP3 và RORγt của các nhóm 65 nghiên cứu (n = 80) Biểu đồ 3.6: Tỉ số FOXP3/RORγt của các nhóm nghiên cứu (n = 80) 66 Biểu đồ 3.7: Mức độ biểu hiện FOXP3 và RORγt của 5 nhóm nghiên 68 cứu (n = 80) Biểu đồ 3.8: Tỉ số FOXP3/RORγt của 5 nhóm nghiên cứu (n = 80)) 69 Biểu đồ 3.7: Mức độ biểu hiện FOXP3 và RORγt của 5 nhóm nghiên 67 cứu (n = 80) Biểu đồ 3.