Luận án quy trình nuôi cấy, bảo quản tạo cốt bào từ tế bào gốc tủy xương

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Tế bào gốc (TBG) là những tế bào chưa biệt hóa, không có chức năng chuyên biệt nhưng có tiềm năng biệt hóa cao. Tùy theo nguồn gốc mà chúng có khả năng biệt hóa thành bất kỳ dòng tế bào mong muốn nào phụ thuộc vào điều kiện của môi trường nuôi cấy. Do có những đặc tính quan trọng này mà tế bào gốc trở thành một lĩnh vực đầy hứa hẹn trong việc cung cấp nguồn tế bào cho điều trị các bệnh khiếm khuyết về mô, tế bào. Kể cả khiếm khuyết về chức năng cũng như hình thái.

TBG có nhiều loại và có thể tìm thấy ở nhiều cơ quan, tổ chức khác nhau của người trưởng thành, kể cả trong phôi, bào thai. Tùy theo mục đích sử dụng điều trị, TBG được thu gom chiết tách từ những nguồn đã được lựa chọn một cách thích hợp. Trong nhiều phương pháp điều trị bằng TBG thì một trong những nguồn cung cấp TBG thường được lựa chọn là tủy xương. Tủy xương là một tổ chức có chứa nhiều loại TBG với khả năng tăng sinh, biệt hóa khác nhau và có thể thu gom tương đối dễ dàng và an toàn [1].

Tổn thương xương, khớp là tổn thương thường gặp do nhiều nguyên nhân gây nên, diễn biến phức tạp, điều trị không đơn giản. Từ hàng nghìn năm trước con người đã biết tìm nhiều cách phục hồi các thiếu hụt về xương nhằm duy trì các chức năng vận động của cơ thể. Các phẫu thuật ghép xương tự thân, ghép xương đồng loại, ghép các vật liệu thay thế xương, thậm chí đang có nhiều công trình nghiên cứu ghép xương dị loài đều nhằm điều trị các bệnh thiếu hụt xương. Các phương pháp trên tuy đã mang lại nhiều tiến bộ trong y học, song mỗi phương pháp đều có những nhược điểm khó khắc phục.

Một số nghiên cứu tại Mỹ cho thấy có đến 5% các bệnh lý về xương không thể chữa liền bằng các phương pháp điều trị thông thường và họ đã hướng đến liệu pháp tế bào gốc [2]. 2 Nuôi cấy làm tăng số lượng tế bào, biệt hóa để có các dòng tế bào trực tiếp gần với mục đích điều trị. Bảo quản tế bào với mục tiêu tế bào phải được cất giữ nguyên vẹn theo thời gian nhằm lưu trữ, chủ động sử dụng sau này. Đây là hướng nghiên cứu có ý nghĩa thực tiễn hiện đang được nhiều tác giả tiến hành trên thế giới cũng như ở Việt Nam.

Hiện nay tại cơ sở nghiên cứu, hàng ngày chúng tôi cung cấp mô xương cho hàng chục bệnh nhân để ghép. Nhằm mục đích kết hợp áp dụng công nghệ tế bào gốc với công nghệ ghép mô xương mà mục tiêu trước mắt là xây dựng được các quy trình phân lập, nuôi cấy, biệt hóa, bước đầu đánh giá khả năng tạo xương trên thực nghiệm và bảo quản dòng tế bào này, chúng tôi tiến hành đề tài: "Nghiên cứu thực nghiệm áp dụng quy trình nuôi cấy và bảo quản tạo cốt bào biệt hóa từ tế bào gốc trung mô tủy xương". Đề tài gồm 2 mục tiêu: 1. Tách chiết phân lập, nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc trung mô tủy xương thỏ.

Biệt hóa tế bào gốc trung mô thành tạo cốt bào và bảo quản sau biệt hóa. 3 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.Đại cương về tế bào gốc 1. Khái niệm về tế bào gốc Tế bào gốc là những tế bào chưa biệt hóa, chúng có khả năng biệt hóa thành các kiểu tế bào chức năng. Chúng có vai trò như hệ thống sửa chữa mô, tạo ra những tế bào khác hoạt động bình thường trên cơ thể sinh vật.

Một tế bào gốc có ít nhất hai đặc tính dưới đây: Tính tự làm mới: tế bào đó có khả năng tiến hành một số lượng lớn chu kỳ phân bào, mà vẫn duy trì trạng thái không biệt hóa.Tế bào gốc trong bất cứ mô nào cũng có một quần thể có khả năng tự làm mới [3],[4],[5]. Khả năng tự làm mới của tế bào gốc [5] 4 Tính biệt hóa: Là quá trình trong đó một tế bào chưa biệt hóa trở thành tế bào chuyên hóa về chức năng. Trong suốt quá trình biệt hóa, do sự điều hòa biểu hiện gen, một số gen nhất định được biệt hóa trong khi những gen khác bị bất hoạt dẫn đến các tế bào được biệt hóa phát triển những cấu trúc đặc hiệu và thực hiện những chức năng nhất định [5],[6],[7].Khả năng biệt hóa tế bào gốc tạo máu và tế bào gốc trung mô trong tủy xương. (Nguồn © 2001 Terese Winslow, Lydia Kibiuk stemcells.

Hoạt động của tế bào gốc Hiểu biết chu kỳ sống và những yếu tố có thể ảnh hưởng đến hoạt động của tế bào gốc và tế bào tiền thân rất quan trọng. Chu kỳ sống của tế bào gốc hoặc tiền thân là một quá trình được điều hòa bởi 5 hoạt động cơ bản: hoạt hóa, phân chia, di cư, biệt hóa và hoạt động chức năng [5] (Hình 1. Quá trình hoạt động tế bào gốc [5] Quá trình hoạt hóa tế bào gốc và tế bào tiền thân từ tủy xương và các nguồn mô khác chịu ảnh hưởng bởi yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu (platelet-derived growth factor -PDGF), và yếu tố tăng trưởng biểu bì (epidermal growth factor -EGF) để cảm ứng và duy trì phát triển quần thể tế bào tiền thân từ các tế bào tủy xương. Khi quá trình hoạt hóa xảy ra có những bằng chứng cho thấy EGF, PDGF, yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi (fibroblast growth factor-2; FGF-2), yếu tố phát triển nội mô mạch(vascular endothelial growth factor receptor-2; VEGF) tăng và giảm nồng độ oxy máu [8],[9].

Trong trường hợp bệnh lý, mô tổn thương hay đáp ứng với các kích thích sinh lý thì sự huy động tế bào gốc tới nơi tổn thương tăng lên.Chẳng hạn khi gãy xương nồng độ oxy tại đó giảm, làm tăng chemokines CXCL2 dẫn đến tăng sự di cư tế bào gốc mô xương ở màng xương và tủy xương đến vùng tổn thương [10] (Hình 1. Sự di cư của tế bào gốc tại vùng gãy xương [10]. Sự di chuyển của tế bào gốc tại vết thương rất quan trọng đối với quá trình hoạt hóa tại mô. Quá trình di chuyển thường diễn ra thuận lợi bởi nhiều cytokine và phụ thuộc vào khả năng chất nền hoặc chất đệm mà tế bào có thể gắn vào và di chuyển.

Chất đệm có thể là khối fibrin, chất đệm ngoại bào, hoặc vật liệu hydroxyapatitle (HA) hoặc ceramic. Nói chung, sự huy động tế bào đòi hỏi một chuỗi các sự kiện phối hợp với nhau, đó là tín hiệu hóa ứng động, tín hiệu giúp tế bào di cư. Sự biệt hóa tế bào chịu ảnh hưởng bởi những yếu tố sinh học quan trọng là áp lực oxy, độ pH của dịch kẽ, dinh dưỡng và các tác nhân kích thích cơ học cũng như bởi thành phần hóa học của chất nền xung quanh. 7 Chết theo chương trình (apoptosis) là một quá trình quan trọng trong phát triển, tái tạo và đổi mới mô.

Tế bào gốc nhạy cảm với những tín hiệu có thể cảm ứng quá trình chết theo chương trình suốt chu kỳ sống của chúng [5]. Phân loại tế bào gốc (theo cách thức tạo ra tế bào gốc) - Tế bào gốc phôi (embryonic stem cell) Tế bào gốc phôi được thu nhận trực tiếp từ phôi (embryo) của người và động vật có vú, chúng có tiềm năng biệt hóa lớn nhất. Nhóm này gồm các tế bào được thu nhận từ mầm phôi giai đoạn phôi nang. - Tế bào gốc trưởng thành (Adult stem cell) Tế bào gốc trưởng thành được thu nhận từ cơ thể trưởng thành.

Ngày càng phát hiện có nhiều tế bào gốc trưởng thành, trong đó tế bào gốc tủy xương được biết rõ hơn cả. Tủy xương là nơi có nhiều tế bào gốc tạo máu, đó là nguồn quan trọng trong cơ chế điều hòa số lượng tế bào máu. Ngoài tế bào gốc tạo máu, tủy xương còn được biết như là một trong các mô có chứa nguồn tế bào trung mô. Nguồn tế bào này có tính linh hoạt cao, chúng có thể biệt hóa hay chuyển biệt hóa thành nhiều kiểu tế bào chức năng khác nhau.

Một nguồn thu nhận tế bào gốc nữa là từ thai, mô cuống rốn, máu cuống rốn, nhau thai, dịch ối, biểu mô dây rốn. Nguồn tế bào gốc thu từ phần bỏ sau khi sinh như máu cuống rốn, nước ối hay rau thai chủ yếu là tế bào gốc tạo máu và tế bào gốc trung mô. Những tế bào gốc này không đủ đặc điểm tế bào gốc phôi nên có thể xếp chúng vào nhóm tế bào gốc ở cơ thể trưởng thành. - Tế bào gốc nhân tạo (tế bào gốc vạn năng cảm ứng) Đây là tế bào gốc do chính con người tạo ra nhờ kỹ thuật thao tác gen, thuật ngữ chính xác để chỉ tế bào này là “tế bào gốc vạn năng cảm ứng” (induced Pluripotent stem cell- iPS).

Về nguyên tắc bất kỳ tế bào sinh dưỡng 8 nào đều có thể trở thành iPS, nhờ chúng được cảm ứng bằng phương pháp chuyển gen in vitro. Khi được kích hoạt, các tế bào sinh dưỡng sẽ khởi động cơ chế tái thiết lập chương trình bộ gene hay sự khử biệt hóa [2]. Tế bào gốc của tủy xương Tế bào gốc của tủy xương (TBGTX) đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi [1],[11]. Tủy xương là nơi cư trú của một hỗn hợp các TBG có khả năng tái tạo và biệt hóa khác nhau: TBG tạo máu (heamopoietic stem cell- HSC) [1],[11],[12], tế bào gốc trung mô (mensenchymal stem cell - MSC) [13],[14], tế bào tiền thân nội mạc (Endothelial stem/progenitor cells- EPC) [15], ngoài ra còn có một số loại TBG khác hiếm gặp hơn và sự tồn tại của chúng vẫn còn đang gây tranh cãi như quần thể tế bào phụ (Side population-SP).

Trong số đó, TBG tạo máu và tế bào gốc trung mô đã được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi. Các TBG của tủy xương trước hết đều mang đặc tính chung của TBG đồng thời có những đặc tính riêng, chuyên biệt cho từng loại TBG. Khả năng biệt hóa và tính linh hoạt của chúng là cơ sở cho liệu pháp điều trị bằng TBG của tủy xương, chúng có thể được sử dụng để tái tạo nhiều cơ quan, tổ chức khác nhau: cơ, xương, sụn, cơ tim.Tế bào gốc trung mô (MSC) Trong tủy xương MSC cũng như những tế bào của tổ chức đệm không trực tiếp nhưng gián tiếp tham gia vào tạo máu bằng cách tạo ra vi môi thích hợp cho tạo máu. MSC tăng sinh và giữ được kiểu hình không biệt hóa qua nhiều lần cấy chuyển.

MSC có khả năng tăng sinh cao, với 35 lần nhân đôi in vitro [16].