Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu biến đổi di truyền virus cúm H5N1 Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN MẠNH KIÊN NGHIÊN CỨU SỰ BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA POLYMERASE CỦA VIRUS CÖM A/H5N1 ĐƢƠNG NHIỄM TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành : HÓA SINH Y HỌC Mã số : 62 72 01 12 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. ĐẶNG THỊ NGỌC DUNG HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án của mình, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới các Thầy (Cô): - PGS. Lê Thanh Hòa – Viện Công nghệ sinh học, - PGS. Đặng Thị Ngọc Dung – Trƣờng Đại học Y Hà Nội, đã trực tiếp hƣớng dẫn, tận tình động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành luận án này.

- Thầy Chủ tịch Hội đồng và các Thầy (Cô) trong Hội đồng chấm luận án, cùng các nhà khoa học trong cả nƣớc, đã có nhiều ý kiến quí báu, giúp tôi hoàn thiện luận án của mình. Trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thành luận án của mình, tôi nhận đƣợc sự giúp đỡ quí báu của Nhà trƣờng, đơn vị công tác, tập thể, các nhà khoa học, gia đình và bè bạn. Tôi xin trân trọng cảm ơn: - Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Y Hà Nội; Ban lãnh đạo Bệnh viện quân y 7A, Cục Hậu cần, Quân khu 7, đã tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trƣờng. - Thầy, cô và các anh, chị trong Bộ môn Hóa sinh, Phòng Quản lý đào tạo Sau đại học, Trung tâm Gen và Protein – Trƣờng Đại học Y Hà Nội, Phòng Miễn dịch học – Viện Công nghệ sinh học, đã tạo điều kiện giúp đỡ chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thành luận án.

- Cơ quan thú y các vùng trong cả nƣớc hết lòng ủng hộ, cung cấp mẫu bệnh phẩm và thông tin dịch bệnh giúp tôi thực hiện đề tài nghiên cứu. - Ban chủ nhiệm đề tài: “Nghiên cứu virus cúm A/H5N1 ở Việt Nam và Thái Lan: Dịch tễ phân tử, chẩn đoán và vắc-xin phòng chống”, trong khuôn khổ Nhiệm vụ “Nghị định thƣ hợp tác nghiên cứu với Thái Lan”, đã giúp đỡ hỗ trợ tôi kinh phí thực hiện đề tài nghiên cứu của mình. - Cuối cùng, tôi xin đƣợc cảm ơn gia đình và ngƣời thân, đã hỗ trợ động viên tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu của mình. Hà Nội, ngày …tháng 8 năm 2014 NGHIÊN CỨU SINH Nguyễn Mạnh Kiên LỜI CAM ĐOAN - Tôi xin cam đoan số liệu trong luận án là một phần số liệu đề tài nghiên cứu Nghị định thƣ hợp tác nghiên cứu với Thái Lan có tên: “Nghiên cứu virus cúm A/H5N1 ở Việt Nam và Thái Lan: Dịch tễ phân tử, chẩn đoán và vắc - xin phòng chống”.

Phần kết quả trong đề tài luận án này là thành quả nghiên cứu của tập thể mà tôi là một thành viên chính. Tôi đã đƣợc sự đồng ý của Chủ nhiệm đề tài và toàn bộ các thành viên trong nhóm nghiên cứu, cho phép sử dụng phần số liệu trên vào trong luận án để bảo vệ lấy bằng tiến sĩ. - Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là hoàn toàn trung thực. Một phần số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án đã đƣợc công bố trên các Tạp chí khoa học chuyên ngành, với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả.

Phần còn lại chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kì công trình nào khác. Hà Nội, ngày ….tháng 08 năm 2014 TÁC GIẢ Nguyễn Mạnh Kiên i MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục i Danh mục chữ viết tắt trong luận án iv Danh mục các bảng v Danh mục các hình và sơ đồ vii ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chƣơng 1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VIRUS CÚM A 3 1. Cấu tạo chung của virus cúm A 3 1.

Đặc điểm cấu tạo hệ gen của virus cúm A 4 1. Cấu tạo và chức năng của các phân đoạn RNA hệ gen virus cúm A 5 1. Đặc điểm cấu tạo và chức năng của các gen PB2, PB1 và PA 7 1. Phức hợp enzym polymerase của virus cúm A 12 1.

Đặc tính biến đổi di truyền các gen và hệ gen virus cúm A 14 1. ĐẠI DỊCH CÚM A VÀ ĐẶC ĐIỂM BIẾN ĐỔI CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA VIRUS CÚM A GÂY ĐẠI DỊCH CÚM Ở NGƢỜI 16 1. Các đại dịch cúm A ở ngƣời trong lịch sử 16 1. Đặc điểm biến đổi các gen PB2, PB1 và PA của virus cúm A gây đại dịch cúm ở ngƣời 17 1.

ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ VÀ SINH HỌC VIRUS CÚM A/H5N1 22 1. Đặc điểm dịch tễ virus cúm A/H5N1 22 1. Đặc điểm sinh học của virus cúm A/H5N1 26 1. NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI CÁC GEN PB2, PB1, PA LIÊN QUAN ĐỘC LỰC VÀ LÂY TRUYỀN Ở NGƢỜI CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 28 1.

Trên thế giới 28 1. Tại Việt Nam 30 Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2. ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 33 2.

Đối tƣợng và vật liệu nghiên cứu 33 2. Dụng cụ, trang thiết bị 35 2. Các bộ kit sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu 36 2. Môi trƣờng sử dụng trong dòng hóa 36 2.

Các hóa chất sử dụng trong điện di trên gel agarose 36 ii 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2. Kỹ thuật tách chiết ribonucleic acid tổng số 38 2. Thiết kế các trình tự mồi nucleotide sử dụng trong nghiên cứu 38 2.

Kỹ thuật RT-PCR 41 2. Tinh sạch DNA sản phẩm PCR 44 2. Kỹ thuật điện di nucleic acid trên gel agarose 45 2. Kỹ thuật dòng hóa DNA 45 2.

Giải trình tự DNA 48 2. Xử lí, kiểm chứng, thu nhận trình tự nucleotide và amino acid của các gen nghiên cứu 50 2. VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 52 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 53 3.

KẾT QUẢ THU NHẬN VÀ GIẢI TRÌNH TỰ CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU 53 3. Kết quả tách chiết RNA tổng số và chuyển đổi cDNA hệ gen virus 53 3. Kết quả PCR thu nhận và dòng hóa DNA các gen PB2, PB1 và PA 54 3. Kết quả giải trình tự DNA các gen PB2, PB1 và PA 60 3.

KẾT QUẢ SO SÁNH THÀNH PHẦN NUCLEOTIDE VÀ AMINO ACID CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC CHỦNG THẾ GIỚI 61 3. Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB2 61 3.1 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB2 61 3.2 Kết quả so sánh tỉ lệ tƣơng đồng về nucleotide và amino acid gen PB2 65 3. Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB1 67 3.1 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB1 67 3.2 Kết quả so sánh tỉ lệ tƣơng đồng về nucleotide và amino acid gen PB1 69 3.3 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB1-F2 69 3.4 Kết quả xác định trình tự khung đọc mở gen PB1-N40 73 3. Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PA 73 3.1 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PA 73 3.2 Kết quả so sánh tỉ lệ tƣơng đồng về nucleotide và amino acid gen PA 77 3.

KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH PHẢ HỆ NGUỒN GỐC CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU 79 3. Kết quả phân tích xác định phả hệ nguồn gốc gen PB2 79 3. Kết quả phân tích xác định phả hệ nguồn gốc gen PB1 82 3. Kết quả phân tích xác định phả hệ nguồn gốc gen PA 85 iii Chƣơng 4.

VỀ KẾT QUẢ THU NHẬN CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU 88 4. Về kết quả thu nhận các gen PB2, PB1 và PA 88 4. Về qui trình nghiên cứu thu nhận các gen PB2, PB1 và PA 88 4. VỀ KẾT QUẢ SO SÁNH THÀNH PHẦN NUCLEOTIDE VÀ AMINO ACID CÁC GEN PB2, PB1, PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC CHỦNG CỦA THẾ GIỚI 89 4.

Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PB2 89 4. Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PB1 93 4.1 Về kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB1 93 4.2 Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PB1-F2 94 4.3 Về kết quả xác định trình tự khung đọc mở gen PB1-N40 96 4. Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PA 97 4. VỀ KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH PHẢ HỆ NGUỒN GỐC CÁC GEN PB2, PB1, CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC CHỦNG CỦA THẾ GIỚI 99 4.

Về kết quả xác định phả hệ nguồn gốc gen PB2 99 4. Về kết quả xác định phả hệ nguồn gốc gen PB1 102 4. Về kết quả xác định phả hệ nguồn gốc gen PA 103 4. PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI PHỨC HỢP ENZYM POLYMERASE, TỔ HỢP CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC CHỦNG CỦA THẾ GIỚI 105 4.

Về đặc điểm biến đổi phức hợp enzym polymerase liên quan bệnh học và dịch tễ học lây truyền sang ngƣời của virus cúm A/H5N1 105 4. Về nguồn gốc tổ hợp các gen PB2, PB1 và PA polymerase 108 KẾT LUẬN 114 KIẾN NGHỊ 116 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iv DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT Chữ viết tắt/ Tên đầy đủ Ký hiệu bp base pair Da dalton DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotide Triphosphate ddNTP Dideoxynucleotide Triphosphate FAO Food and Agriculture Organization HA Hemagglutinin kb kilobase M Matrix protein MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis NA Neuraminidase NEP Nuclear Export Protein NP Nucleoprotein NS Non-structural protein OIE Office International des Epizooties PA Polymerase acidic protein PB1 Polymerase basic protein 1 PB2 Polymerase basic protein 2 RT-PCR Reverse transcription - polymerase chain reaction RNA Ribonucleic acid RNP Ribonucleoprotein (-) ssRNA Negative single-strand Ribonucleic Acid WHO World Health Organization cs. Cộng sự v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1. Tóm tắt đặc tính cấu tạo 8 phân đoạn RNA hệ gen và chức năng các protein của virus cúm A 6 1.

Tóm tắt lịch sử các đại dịch và dịch cúm A ở ngƣời 17 1. Các vị trí thay đổi amino acid trong protein PB2, PB1 và PA, giữa virus cúm A ở gia cầm với chủng virus A/H1N1/1918 và virus cúm A ở ngƣời 19 1. Số ngƣời nhiễm và tử vong do virus cúm A/H5N1 từ 2003 đến nay 23 1.