Luận án: Phân lập, tăng sinh & biệt hóa tế bào gốc ngoại bì thần kinh thành nơron tiết dopamin

MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN. Đặc điểm tế bào gốc thần kinh. Quá trình hình thành và biệt hóa nơron tiết dopamin in vivo.

Tế bào gốc não giữa và nơron tiết dopamin: ứng dụng trong điều trị. Phân lập, nuôi cấy và bảo quản lạnh tế bào gốc sàn não giữa phôi. Nuôi cấy tế bào gốc thần kinh. Định danh tế bào gốc thần kinh và tế bào tiết dopamin.

Định danh tế bào gốc thần kinh. Định danh tế bào tiết dopamin. Bảo quản lạnh tế bào gốc thần kinh và nơron tiết dopamin. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

Địa điểm và thời gian nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu. Các bước tiến hành.

Các bước tiến hành trên phôi chuột. Các bước tiến hành trên phôi người. Chỉ tiêu nghiên cứu. Trang thiết bị, vật tư hóa chất dùng trong nghiên cứu.

Trang thiết bị. Vật tư tiêu hao. Hóa chất, môi trường. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu.

Kỹ thuật hiển vi. Kỹ thuật siêu vi. Kỹ thuật hóa mô miễn dịch. Kỹ thuật đếm tế bào TH.

Xử lí số liệu nghiên cứu. Đạo đức nghiên cứu. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. Phân lập, tăng sinh và bảo quản lạnh tế bào gốc ngoại bì thần kinh não giữa phôi chuột.

Phân lập, nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc ngoại bì thần kinh sàn não giữa phôi chuột theo nhóm tuổi. Nuôi cấy tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi chuột E12,5 – E13,5. Bảo quản lạnh tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi. Phân lập và nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi người 74 3.

Phân lập tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi người. Nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc biểu mô ống thần kinh phôi người tạo nơron tiết dopamin. 77 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN. Phân lập và nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc ngoại bì thần kinh não giữa phôi chuột.

Xác định vị trí phẫu tích tế bào gốc ngoại bì thần kinh. Thử nghiệm nuôi cấy tế bào gốc ngoại bì thần kinh phân lập từ sàn não giữa trên phôi chuột từ 10,5 đến 14,5 ngày. Nuôi cấy tế bào gốc ngoại bì thần kinh não giữa phôi chuột cống trắng giai đoạn E12,5 – E13,5. Bảo quản lạnh tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi.

Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi người. Thuận lợi và khó khăn trong quá trình thu thập phôi và phân lập tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi người. Cấu trúc của biểu mô ống thần kinh phôi người 6,5 - 7,5 tuần tuổi 102 4. Sự phát triển của các tế bào nuôi cấy và định danh các tế bào sau nuôi cấy.

Hiệu quả nuôi cấy tạo nơron tiết dopamin. 113 KHUYẾN NGHỊ VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP. 115 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Những marker bề mặt tế bào thần kinh nhạy cảm với enzyme.

Phân bố phôi chuột theo độ tuổi. Tỷ lệ trích thủ thành công mẫu mô não giữa qua các giai đoạn. Tỷ lệ mọc mẫu theo tuổi phôi. Tỷ lệ tế bào, cụm tế bào dương tính với marker TH sau nuôi cấy.

Tỷ lệ sống của các tế bào thần kinh sau rã đông. Đánh giá tỷ lệ sống của tế bào theo thời gian. Sự phân bố tuổi phôi, khả năng phẫu tích, phân lập của các phôi. Tổng số tế bào sau phân lập và tỷ lệ tế bào sống.

Sự phân bố số tế bào dương tính với TH trong giếng nuôi cấy theo tuổi phôi. 81 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3. Tổng số tế bào sau phân lập. Tỷ lệ mọc mẫu nuôi cấy sau rã đông.

Sự gia tăng số lượng tế bào dương tính với TH theo ngày nuôi cấy. 82 DANH MỤC HÌNH Hình 1. Các nguồn tế bào khác nhau trong điều trị bệnh Parkinson. Sự tăng sinh tế bào ở ống thần kinh.

Các lớp của lá đáy não giữa và sự biểu hiện các gen liên quan đến sự phát triển của tế bào mDA. Hình ảnh chụp PET với 6-L- fluorodopa ở vùng nhân bèo nhạt và bèo sẫm.1: Sơ đồ nghiên cứu nuôi cấy tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi chuột cống trắng tạo nơron tiết dopamin. Phẫu tích não giữa theo Jan Pruszak và cộng sự. Cấu tạo vi thể não giữa phôi chuột cống trắng.

Sàn mô não giữa. Sàn não giữa phôi chuột cống trắng E13. Cấu trúc siêu vi của biểu mô thần kinh não giữa E11. Tế bào lớp nội tủy đang phân chia.

Cấu trúc siêu vi của nguyên bào thần kinh E11. Các tế bào đang trong quá trình biệt hóa của phôi E13. Các nhánh bào tương của các nơron não giữa phôi E12. Các nhánh bào tương tập trung thành nhóm ở phôi E12.

Nón tăng trưởng ở phôi E12. Các tế bào tiền thân tiết dopamine tại thành não giữa phôi chuột cống trắng E11. Số lượng các tế bào tiền thân tiết dopamine tăng ở phôi E13. Các tế bào tiết dopamine tập trung ở vùng sàn não giữa ở phôi chuột cống trắng E13.

Tế bào gốc não giữa nuôi cấy. Hình thái vi thể của tế bào gốc não giữa sau nuôi cấy. Tế bào gốc não giữa sau nuôi cấy 6 ngày. Tế bào gốc não giữa.

Tế bào gốc phôi chuột cống trắng sau nuôi cấy 6 ngày. Nhuộm HMMD với marker Vimentin và TH tế bào gốc não giữa phôi chuột cống trắng sau nuôi cấy. Hình ảnh tế bào nuôi cấy sau rã đông. Phôi người (A) 7 tuần (x50); (B) 8 tuần (x40).

Cấu trúc thành ống thần kinh phôi người 7 tuần. Tế bào gốc thần kinh người nuôi cấy. Tế bào gốc thần kinh người nuôi cấy. Tế bào mô thần kinh nuôi cấy 8 ngày.

Tế bào gốc thần kinh người 10 ngày sau nuôi cấy. Tế bào gốc thần kinh người nuôi cấy nhuộm với Vimentin và TH. 80 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, việc nghiên cứu và ứng dụng những hiểu biết ở cấp độ tế bào và dưới tế bào là những hướng đi mũi nhọn của y học. Một trong những lĩnh vực mũi nhọn ấy là nghiên cứu, tìm hiểu và sử dụng tế bào gốc trong điều trị như việc cấy ghép mô, tế bào vào cơ thể trưởng thành nhằm phục hồi một phần hay toàn bộ chức năng của mô, tế bào sau những thương tổn bệnh lý hay lão hóa, sau những sang chấn cơ học hay do những khuyết tật bẩm sinh.

Những năm gần đây, mặc dù không có số liệu thống kê toàn cầu, nhưng nhu cầu cấy ghép tế bào gốc có xu hướng ngày càng tăng, đặc biệt trong bệnh máu ác tính, các bệnh lý về xương khớp và các bệnh lý về tim mạch. Ngay cả trong các bệnh lý tại hệ thống thần kinh - một loại mô có những tế bào biệt hóa rất cao, tưởng như không thể tự thay mới khi có tổn thương – thì việc nghiên cứu cấy ghép tế bào gốc và liệu pháp gen nhằm thay thế các tế bào thần kinh thoái hóa đang là một hướng đi mang lại nhiều hi vọng mới cho người bệnh. Ý tưởng cấy ghép tế bào gốc để điều trị bệnh Parkinson - là bệnh lý rối loạn thần kinh thoái hóa tiến triển do giảm chức năng các nơron tiết dopamin trong não đã được bắt đầu từ những năm 1980. Trên thế giới, rất nhiều nghiên cứu trên động vật và trên người đã chỉ ra rằng việc ghép tế bào gốc cải thiện đáng kể triệu chứng của bệnh Parkinson [1], [2].

Nhiều loại tế bào gốc khác nhau được thử nghiệm trên động vật: tế bào gốc tủy xương [3], tế bào gốc cảm ứng (iPS cells) [4], tế bào gốc ngoại bì thần kinh của bào thai (mesencephalic neuroepithelial stem cells = M-NECs). Trong số các loại trên, tế bào gốc ngoại bì thần kinh bào thai người đã được thử nghiệm lâm sàng trên người và đã mang lại kết quả tích cực do các tế bào ở đây có tỷ lệ biệt hóa thành các neuron tiết dopamin sau ghép cao, mô ghép hòa hợp tốt với mô chủ và chưa có bằng chứng nào về việc tiết dopamin bất thường từ các mảnh ghép trên mô chủ. 2 Ở Việt Nam hiện nay, tỷ lệ mắc bệnh Parkinson khoảng 1,6% ở những người trên 65 tuổi, và có xu hướng ngày càng tăng với tỷ lệ mắc mới khoảng 20/100 000 dân/năm. Thêm vào đó, điều trị nội khoa bằng cách sử dụng các thuốc là tiền chất chuyển hóa của dopamin như Levodopa cũng chỉ có tác dụng tốt trong khoảng 5-10 năm do hiện tượng kháng thuốc điều trị [5].

Vì vậy, việc nghiên cứu một phương pháp điều trị mới, có khả năng giải quyết được nguyên nhân gây bệnh là vô cùng cần thiết để hạn chế nguy cơ tàn phế do bệnh tật, nâng cao chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân. Với mong muốn tiếp cận một phương pháp mới trong điều trị bệnh Parkinson cũng như mong muốn nâng cao chất lượng cuộc sống cho người bệnh, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập, tăng sinh và biệt hóa tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi – thai thành tế bào dạng tiết dopamin” với mục tiêu: Commented [M1]: Nơron 1. Phân lập, tăng sinh, biệt hóa và bảo quản lạnh tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi chuột cống trắng thành tế bào dạng tiết dopamin. Bước đầu phân lập, tăng sinh và biệt hóa được tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi – thai người thành tế bào dạng tiết dopamin.

3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Đặc điểm tế bào gốc thần kinh Tế bào gốc thần kinh được Atlman và cộng sự mô tả lần đầu tiên năm 1962. Rất nhiều nguồn gốc tế bào khác nhau đã được sử dụng để tạo nơron tiết dopamin, đầu tiên có thể kể đến như: tế bào gốc trung mô phân lập từ tủy xương hay tế bào vùng hành khứu ở vỏ não. Tuy nhiên những dòng tế bào này khá hạn chế trong việc tạo thành các nơron tiết dopamin trên thực nghiệm.

Vì vậy ngày nay, các nhà khoa học thường tập trung vào một số dòng tế bào khác có tiềm năng lớn hơn tạo nơron tiết dopamin như: tế bào gốc não giữa phôi, tế bào gốc phôi giai đoạn sớm (khối tế bào nội phôi của phôi nang), tế bào gốc vạn năng cảm ứng (iPSCs) (Hình 1. Các nguồn tế bào khác nhau trong điều trị bệnh Parkinson [6] Mọi loại tế bào gốc thần kinh đều có ích trong nghiên cứu y học, nhưng mỗi dòng tế bào lại có triển vọng phát triển cũng như giới hạn riêng.