Luận án tiến sĩ công nghệ sinh học nghiên cứu tác động của nano bạc và nano sắt lên chất lượng cây giống in vitro

LỜI CẢM ƠN Đối với tôi khoảnh khắc đầu tiên mà không thể nào quên được là lúc lên 6 tuổi, ba mẹ gửi tôi cho một Cha nhà thờ để tôi được đi học mẫu giáo. Cuộc sống của tôi gắn liền với nhà thờ cho đến khi tôi học xong đại học. Khoảnh khắc thứ hai đó là lúc tôi bước vào phòng Sinh học Phân tử và chọn tạo giống cây trồng để học môn Công nghệ Sinh học Thực vật. Chính môi trường làm việc, thầy cô, anh chị và các bạn sinh viên ở đây đã mở ra cho tôi một chân trời mới, một ước mơ mới.

Để có được như ngày hôm nay, tôi biết bản thân đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của mọi người. Người mà tôi biết ơn sâu sắc nhất là Thầy - GS. Dương Tấn Nhựt (Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên). Thầy đã tận tình chỉ bảo cho tôi biết thế nào là nghiên cứu khoa học, qua sự giảng dạy của Thầy, cả một bầu trời trí thức mở ra trước mắt tôi; cho tôi biết sự ưu tú trong nghề nhà giáo không chỉ là kiến thức mà hơn hết đó là đạo đức, là phong cách sư phạm.

Tôi sẽ không bao giờ biết được những điều kỳ diệu ấy nếu như không có sự tâm huyết, nhiệt tình tận tụy của Thầy. Tôi sẽ mãi khắc ghi những lời răn dạy nghiêm khắc trong những cuộc họp; hay những câu chuyện hóm hỉnh nhưng đầy tính triết lý - nhân văn trong cuộc sống ở các bữa ăn, những chuyến đi hội nghị - công tác. Tôi cảm thấy mình rất vinh dự khi được sống, được làm việc cùng Thầy. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Cô - PGS.

Trương Thị Bích Phượng (Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế). Cô luôn tận tình giúp đỡ cũng như động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận án. Tôi xin cảm ơn TS. Hoàng Thanh Tùng, người đã dành thời gian, nhiệt tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong quá trình viết và chỉnh sửa luận án.

Qua đó, tôi đã học được rất nhiều kiến thức và kỹ năng trong nghiên cứu khoa học. Cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí của các đề tài, dự án của phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo giống cây trồng - Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên đã hỗ trợ cho tôi hoàn thành luận án này. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các Anh, Chị, các bạn sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh ở phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo giống cây trồng - Viện i Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, nơi tôi thực hiện các nội dung chính trong luận án, đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện thí nghiệm và hoàn thành luận án này. Tôi xin cảm ơn ban giám hiệu Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế, Quý Thầy Cô phòng Sau Đại học, Quý Thầy Cô Khoa Sinh học đã cung cấp cho tôi kiến thức và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường.

Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Khoa học Tây nguyên và Ban lãnh đạo Công ty cổ phần Công nghệ Sinh học Thái Dương đã cho phép và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến ba mẹ người đã sinh ra con, đã luôn bên cạnh, động viên và tạo điều kiện để con được học tập, nghiên cứu. Anh cảm ơn Vợ - người đã luôn yêu thương và đồng hành cùng anh trong mọi chặng đường đi. Lâm Đồng, ngày tháng năm 2022 Đỗ Mạnh Cường ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nghiên cứu “Nghiên cứu tác động của nano bạc và nano sắt lên chất lượng cây giống in vitro ở một số cây trồng có giá trị kinh tế” là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của GS.

Dương Tấn Nhựt và PGS. Trương Thị Bích Phượng. Nghiên cứu này là một phần trong nhánh số 3 của Dự án trọng điểm cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam “Nghiên cứu tác động của hạt nano kim loại lên khả năng tái sinh, sinh trưởng phát triển và tích luỹ hoạt chất trong quá trình nhân giống một số cây trồng có giá trị kinh tế cao ở Việt Nam” thuộc Hợp phần IV “Nghiên cứu cơ chế tác động và đánh giá an toàn sinh học của các chế phẩm nano”, mã số: VAST.04/15-18 và đề tài “Thiết lập phương pháp mới trong khử trùng mẫu, môi trường nuôi cấy và khắc phục một số hiện tượng bất thường trong vi nhân giống trên một số đối tượng cây trồng có giá trị kinh tế”, Mã số: 106.301 của Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED). Đề tài nghiên cứu được thực hiện tại phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo Giống cây trồng thuộc Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên.

Các số liệu và hình ảnh trình bày trong luận án là trung thực khách quan, nghiêm túc và chưa được sử dụng để công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về sự cam đoan này. Lâm Đồng, ngày tháng năm 2022 Đỗ Mạnh Cường iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid AAS : Atomic Absorbtion Spectrometric (phương pháp Quang phổ hấp phụ nguyên tử) ACC : 1-Aminocyclopropane-1-Carboxylic Acid ACS : ACC Synthase Ag : Bạc AgNO3 : Bạc nitrat AgNPs : Các hạt nano bạc BA : Benzyladenine BAP : Benzylaminopurine DNA : Deoxyribonucleic Acid EDTA : Ethylenediamine Tetra Acetate Fe : Sắt FeNPs : Các hạt nano sắt GA3 : Gibberellic acid GC : Gas chromatography (hệ thống Sắc ký khí GC) HCl : Chlohydric Acid HNO3 : Nitric Acid IBA : 3-Indolebutyric Acid IBA : 3-Indolebutyric acid Kin : Kinetin MS : Môi trường Murashige và Skoog (1962) NAA : Naphthaleneacetic acid SAM : S-adenosyl-L-methionine SEM : Scanning Electron Microscope (Kính hiển vi điện tử quét) SH : Môi trường Schenk và Hildebrandt (1972) SPSS : Statistical Package for the Social Sciences (Phần mềm thống kê cho các ngành khoa học xã hội) TDZ : Thidiazuron iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN. i LỜI CAM ĐOAN.

iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT. iv MỤC LỤC. v DANH MỤC BẢNG. x DANH MỤC HÌNH.

xii DANH MỤC BIỂU ĐỒ. xiv MỞ ĐẦU. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. 5 Vi nhân giống.

Khái niệm vi nhân giống. Các giai đoạn trong vi nhân giống thực vật. Khử trùng bề mặt. Phát sinh hình thái.

Cây hoàn chỉnh và thích nghi vườn ươm. Một số hạn chế trong vi nhân giống thực vật. Tích luỹ khí ethylene. Hoá nâu mẫu cấy.

15 Nano kim loại. Giới thiệu chung. Ứng dụng nano kim loại trong vi nhân giống thực vật. AgNPs và FeNPs trong vi nhân giống thực vật.

AgNPs trong vi nhân giống thực vật. FeNPs trong vi nhân giống thực vật. Hấp thu, vận chuyển và chuyển hóa nano kim loại trong cây. Tính an toàn sinh học của các nano kim loại.

27 Sơ lược về các đối tượng cây trồng sử dụng trong nghiên cứu. Sâm Ngọc Linh. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Vật liệu thực vật.

Dung dịch nano. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất. 34 Nội dung nghiên cứu. Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu cấy.

Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên sự phát sinh hình thái các loại mẫu trong nuôi cấy in vitro. Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi trong nuôi cấy in vitro. Nghiên cứu khả năng sinh trưởng tiếp theo của cây con in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro. 36 Phương pháp nghiên cứu.

Phương pháp bố trí thí nghiệm. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu cấy. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên sự phát sinh hình thái các loại mẫu trong nuôi cấy in vitro. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi trong nuôi cấy in vitro.

Thí nghiệm 4: Theo dõi khả năng thích nghi, sinh trưởng, phát triển và tích luỹ hoạt chất của cây con in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro. Phương pháp theo dõi các chỉ tiêu. Phương pháp quan sát bề mặt mô sẹo. Phương pháp giải phẫu thực vật.

Phương pháp quan sát và đếm số lượng tế bào. Phương pháp xác định hàm lượng khí ethylene. Phương pháp xác định hàm lượng AgNPs hấp thụ. Phương pháp phân tích định lượng saponin (G-Rg1, M-R2, G-Rb1).

44 Điều kiện nuôi cấy. 44 Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm. 44 Phương pháp xử lý thống kê. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN.

46 Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu cấy. Ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây salem. Ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây dâu tây. Ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây sâm Ngọc Linh.

52 Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên sự phát sinh hình thái các loại mẫu trong nuôi cấy in vitro. Ảnh hưởng của AgNPs lên sự gia tăng số lượng tế bào từ mô sẹo cây salem nuôi cấy in vitro. Ảnh hưởng của AgNPs lên sự tái sinh chồi từ huyền phù tế bào cây salem nuôi cấy in vitro. Ảnh hưởng của AgNPs lên quá trình phát sinh và tăng sinh phôi từ mô sẹo sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro.

62 Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi nuôi cấy in vitro. Ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi cây salem nuôi cấy in vitro. Ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi cây dâu tây nuôi cấy in vitro. Ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro.

74 Khả năng sinh trưởng tiếp theo của cây con in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro. Khả năng sinh trưởng tiếp theo của cây salem in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro .