Luận án: Biểu hiện pectinase nấm mốc trong Pichia pastoris - Phan Thị Thanh Diễm

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC PHAN THỊ THANH DIỄM NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC VÀ BIỂU HIỆN PECTINASE TỪ NẤM MỐC TRONG Pichia pastoris TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 9 42 02 01 Người hướng dẫn Khoa học: PGS. TRẦN QUỐC DUNG PGS. PHẠM THỊ NGỌC LAN HUẾ, 2024 Công trình đã được hoàn thành tại: Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế Người hướng dẫn khoa học: PGS. TRẦN QUỐC DUNG PGS.

PHẠM THỊ NGỌC LAN Phản biện 1: …………………………. Phản biện 3: ………………………… Luận án sẽ bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Đại học, họp tại: Đại học Huế. năm …… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Pectinase là enzyme phân giải các cơ chất pectin, phân tách polygalacturonic acid thành monoglacturonic acid bằng cách mở các liên kết glycosid và phá vỡ liên kết ester giữa các nhóm carboxyl và methyl.

Chúng đang được sử dụng rộng rãi cho các ứng dụng công nghiệp khác nhau như công nghiệp chế biến thực phẩm, lên men cotton, tách rời các sợi thực vật, lên men trà và cà phê, lên men thức ăn gia súc. Trong lĩnh vực chế biến trái cây, pectinase được sử dụng nhằm mục đích gia tăng hiệu suất thu hồi dịch quả, cải thiện chất lượng và có tác dụng làm trong dịch quả … Trên thực tế, việc sản xuất pectinase tái tổ hợp từ một số chủng nấm mốc thuộc chi Aspegillus, đặc biệt là loài A. niger (được FDA công nhận là GRAS) đã được ghi nhận. Tuy nhiên giá thành các chế phẩm pectinase còn khá cao do chí phí sản xuất cao, điều này sẽ hạn chế khả năng ứng dụng của pectinase.

niger là một vi sinh vật an toàn và chủng này không tạo ra độc tố nấm hoặc kháng sinh trong các điều kiện để sản xuất enzyme, nhưng hoạt động của enzyme tự nhiên không đủ cao cho các ứng dụng công nghiệp và rất khó để tinh sạch. Trong khi đó các chủng vi sinh vật dùng để sản xuất pectinase có thể được thao tác về mặt di truyền để cải thiện chủng và tăng năng suất. Do đó, để tạo nguyên liệu di truyền sản xuất các pectinase tái tổ hợp người ta đẩy mạnh nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gen pectinase trong các tế bào chủ khác nhau. Biểu hiện tái tổ hợp có thể chọn lọc chủng loại pectinase và định hướng sinh tổng hợp pectinase ngoại bào, có năng suất cao, dễ tinh sạch và có tiềm năng phát triển thành sản phẩm thương mại.

Ở Việt Nam hiện vẫn chưa có công bố nào nghiên cứu về tạo dòng và biểu hiện gen pectinase, với mục tiêu 1 tạo được nguồn pectinase tái tổ hợp từ nấm mốc có tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu sàng lọc và biểu hiện pectinase từ nấm mốc trong Pichia pastoris.” Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam về biểu hiện gen mã hóa pectinase có nguồn gốc từ nấm mốc trong nấm men P. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2. Mục tiêu chung Tạo được nguồn pectinase tái tổ hợp từ nấm mốc có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ chế biến thực phẩm. Mục tiêu cụ thể Phân lập và tuyển chọn được chủng nấm mốc thuộc chi Aspergillus có khả năng sinh tổng hợp pectinase cao.

Phân lập, tạo dòng và biểu hiện được gen mã hóa pectinase từ chủng nấm mốc được tuyển chọn trong P. Đánh giá được khả năng ứng dụng chế phẩm pectinase tái tổ hợp trong lĩnh vực chế biến thực phẩm (Làm trong nước ép táo và tăng hiệu suất bóc vỏ tiêu). NỘI DUNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU Nội dung nghiên cứu 1. Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc sinh tổng hợp pectinase cao.

Tạo dòng gen pectinase vào hệ thống vector biểu hiện P. Thử nghiệm chế phẩm pectinase tái tổ hợp trong chế biến nước trái cây và khả năng bóc vỏ tiêu. Phạm vi nghiên cứu 2 Tuyển chọn chủng nấm sinh tổng hợp pectinase, tạo dòng gen, biểu hiện trong Pichia pastoris X33, tinh sạch và xác định đặc tính pectinase tái tổ hợp, ứng dụng pectinase tái tổ hợp trong chế biến thực phẩm. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 1.

Tạo dòng thành công và xác định trình tự gen AspPecA, AspPecB và AspPecC mã hóa pectinase từ Aspergillus niger M13 được đăng ký trên Genbank với mã số tương ứng MT502411, MT502412 và MT502413; 2. Lần đầu tiên biểu hiện thành công gen AspPecA mã hóa cho pectinase trong P. rAspPecA tinh sạch được nghiên cứu và xác định một số tính chất; 3. rAspPecA có khả năng làm trong nước ép táo và làm tăng khả năng bóc vỏ tiêu với hiệu suất cao hơn 90%.

CẤU TRÚC LUẬN ÁN Luận án được trình bày trong 135 trang A4 (không tính tài liệu tham khảo). Trong đó, phần Mở đầu 4 trang; Tổng quan tài liệu 35 trang; Vật liệu và Phương pháp nghiên cứu 19 trang; Kết quả nghiên cứu và thảo luận 63 trang; Kết luận và Kiến nghị 2 trang; Danh mục các công trình liên quan đến luận án đã công bố 1 trang; Tài liệu tham khảo 22 trang. Luận án có 9 bảng và 52 hình. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

GIỚI THIỆU CHUNG VỀ PECTIN Pectin là một hợp chất tự nhiên có nhiều trong màng tế bào của các loài thực vật bậc cao, phân bố chủ yếu ở các bộ phận như: quả, củ, thân. Trong màng tế bào pectin có mặt ở phiến giữa (với hàm lượng cao nhất) và ở vách tế bào sơ cấp. Pectin là một polysaccharide cấu trúc được tìm thấy trong thành tế bào sơ cấp và phiến giữa của trái cây và rau quả. Cấu trúc chủ yếu của pectin là homopolymer, được tạo thành từ poly-α-(1,4)-galacturonic acid được methyl hóa một phần.

SƠ LƯỢC VỀ PECTINASE Pectinase là enzyme xúc tác sự thủy phân các polymer pectin. Dưới tác dụng của pectinase, pectin bị thủy phân tạo thành các sản phẩm như galacturonic acid, galactose, arabinose, methanol… Pectinase được sử dụng nhiều trong công nghiệp chế biến trái cây nhằm mục đích gia tăng hiệu suất thu hồi dịch quả, cải thiện chất lượng dịch quả và có tác dụng làm trong dịch quả. NẤM MỐC Aspergillus SINH TỔNG HỢP PECTINASE Chi Aspergillus phân biệt với các chi khác trong lớp nấm bất toàn nhờ chúng có hệ bào tử đính phát sinh từ thể bình. Cơ quan sinh bào tử trần phát triển từ một tế bào đặc biệt gọi là tế bào chân có đường kính lớn hơn, màng dày hơn các tế bào lân cận của sợi nấm.

Từ tế bào chân phát triển thành giá bào tử trần (condiosphore hay stipe). Bọng đỉnh giá có thể có nhiều hình thái khác nhau, đây là một đặc điểm đặc trưng để phân loại Aspergillus với các loại nấm khác 1. HỆ THỐNG BIỂU HIỆN P. pastoris Theo Kielkopf và cs (2021) các P.

pastoris được báo cáo là một trong những hệ thống hữu ích và linh hoạt nhất cho biểu hiện 4 protein dị chủng, do đó chúng đã trở thành một trong những nấm men nghiên cứu rộng rãi nhất. pastoris là hệ thống biểu hiện được sử dụng phổ biến để sản xuất các loại protein tái tổ hợp với nhiều ưu điểm hơn so với Saccharomyces cervisiae. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC VÀ BIỂU HIỆN GEN PECTINASE Trên thế giới nhiều báo cáo cho thấy việc tạo dòng có hiệu quả bằng cách sử dụng nấm mốc thuộc chi Aspergillus và đã biểu hiện thành công gen pectinase như: Liu và cs (2014) đã tạo dòng gen endo-galacturonase A (pgaA) từ chủng A. niger JL-15 và biểu hiện ở P.

Xu và cs đã khuếch đại gen mã hóa gen pectin lyase PNL-ZJ5A từ A. Năm 2017, Abdulrachman và cs đã biểu hiện thành công gen endo- polygalacturonase (endoPG) từ A. Năm 2018, Zhang và cs đã tạo dòng và biểu hiện thành công gen pectin methylesterase (PME-ZJ5A), từ A. niger ZJ5 trong P.

Năm 2021, Famotemi và cs đã tinh sạch và xác định đặc tính của pectinase từ chủng A. niger F7-02 Các nghiên cứu về biểu hiện của gen pectin lyase ở P. pastoris đã được công bố như: Liu và cs (2022), Zhang và cs (2018) đã tạo dòng gen pectin lyase, pectin methylesterase từ A. niger ZJ5 và biểu hiện thành công ở P.

Tuy nhiên, ở Việt Nam hiện vẫn chưa có công bố nào về nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gen pectinase. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Các chủng nấm mốc thuộc chi Aspergillus có khả năng sinh pectinase được phân lập từ một số mẫu vỏ, quả trái cây giàu pectin 5 như cam, chanh, bưởi, quýt, chuối, xoài, táo, khoai tây, cà rốt, thanh long… Mẫu được thu ở các chợ thuộc thành phố Huế: Chợ Bến Ngự, chợ An Cựu, chợ Cống, chợ Phước Vĩnh. Phương pháp nghiên cứu 2. Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh pectinase 2.

Xác định hàm lượng protein 2. Xác định một số đặc điểm hình thái và định danh loài 2. Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy cho sinh tổng hợp pectinase 2. Tạo dòng gen mã hóa pectinase 2.

Biểu hiện gen AspPecA trong P. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện pectinase tái tổ hợp 2. Tinh sạch enzyme tái tổ hợp 2. Xác định trọng lượng phân tử của pectinase 2.

Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ pectinase tái tổ hợp 2. Thử nghiệm ứng dụng pectinase tái tổ hợp 2. Xử lý số liệu 6 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MỐC SINH TỔNG HỢP PECTINASE 3. Phân lập và xác định số lượng tế bào nấm mốc có khả năng phân giải pectin Bảng 3. Số lượng nấm mốc phân giải pectin trong các mẫu phân lập Ký CFU/g Loại mẫu Số chủng pH Đợt phân lập hiệu mẫu (vỏ) nấm mốc mẫu mẫu (×103 ) Đợt 1 Bưởi da xanh MA1 M1-M5 6,7 18,1g (1/6/2017) Cam sành MA2 M6-M7 4,5 6,3l Bưởi da xanh MA3 M8-M13 6,4 20,2f Đợt 2 Quýt đường MA4 M14-M17 4,8 14,6i (12/6/2017) Chuối ba lùn MA5 M18-M20 5,8 7,1k Đợt 3 Bưởi đỏ MA6 M21-M23 6,1 10,2j (14/6/2017) Cam sành MA7 M24-M25 5,1 6,6kl Đợt 4 Bưởi da xanh MA8 M26-M32 6,9 16,2h (28/6/2017) Bưởi năm roi MA9 M33-M39 5,1 17,4gh Đợt 5 Cam dòng MA10 M40-M45 4,5 22,2e (4/7/2017) Chuối tiêu MA11 M46-M49 5,9 20,1f Chanh MA12 M50-M53 4,1 16,6h Đợt 6 Táo MA13 M54-M59 5,2 14,1i (8/7/2017) Xoài MA14 M60-M61 4,7 10,3j Thanh long MA15 M62-M65 5,1 18,1g Đợt 7 Khoai tây MA16 M66-M74 5,8 26,1c (11/7/2017) Cà rốt MA17 M75-M81 6,5 24,3d Bưởi Thanh MA18 M82-M92 6,1 30,3b trà Huế Đợt 8 Bưởi đỏ Huế MA19 M93-M107 6,21 35,1a (2/8/2017) M108- Bưởi đỏ MA20 6,02 26,1c M113 7 3. Sơ tuyển chủng nấm mốc phân giải pectin và xác định hoạt độ enzyme 3.

Sơ tuyển trực tiếp Bảng 3.