Biểu hiện protein interleukin-7 tái tổ hợp trong thực vật - Nguyễn Huy Hoàng

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN HUY HOÀNG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN INTERLEUKIN 7 TÁI TỔ HỢP TRONG HỆ THỐNG NUÔI CẤY THỰC VẬT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2017 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN HUY HOÀNG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN INTERLEUKIN 7 TÁI TỔ HỢP TRONG HỆ THỐNG NUÔI CẤY THỰC VẬT Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. Chu Hoàng Hà 2. Lê Văn Sơn THÁI NGUYÊN - 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS. Chu Hoàng Hà và PGS.

Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, một phần đã được công bố trong các Tạp chí Khoa học; phần còn lại chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Mọi trích dẫn, tham khảo đều ghi rõ nguồn gốc. Thái Nguyên, ngày 25 tháng 11 năm 2017 TÁC GIẢ Nguyễn Huy Hoàng ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. Chu Hoàng Hà, PGS.

Lê Văn Sơn, là những người thầy đã tận tình hướng dẫn, động viên khích lệ, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận án này. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới TS. Phạm Bích Ngọc, TS. La Việt Hồng, ThS.

Lê Thu Ngọc, ThS. Nguyễn Thu Giang cùng toàn thể các cô chú, anh chị và các bạn Phòng Công nghệ tế bào thực vật và Phòng công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học, là những người đã tận tình truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu và giúp đỡ tôi trong quá trình làm thực nghiệm tại phòng. Tôi xin chân thành cảm ơn GS. Chu Hoàng Mậu, PGS.

TS Nguyễn Thị Tâm và các thầy cô giáo khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã giảng dạy, truyền đạt cho tôi những kiến thức mới và tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành được khóa học này. Tôi xin cảm ơn phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi về mặt quản lý trong suốt quá trình tôi học tập tại Trường. Tôi xin cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Y Dược, đồng nghiệp của tôi tại Bộ môn Sinh học, Khoa Khoa học cơ bản và các phòng chức năng đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong công tác để tôi yên tâm học tập. Cuối cùng tôi xin gửi tới gia đình, bạn bè, người thân lòng biết ơn sâu sắc.

Những người luôn luôn ở bên, ủng hộ, động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu của mình Thái Nguyên, ngày 25 tháng 11 năm 2017 TÁC GIẢ Nguyễn Huy Hoàng iii MỤC LỤC Lời cam đoan. ii Mục lục. iii Danh mục chữ viết tắt. iv Danh mục các bảng.

v Danh mục các hình. vi MỞ ĐẦU. Tính cấp thiết của luận án. Mục tiêu nghiên cứu.

Nội dung nghiên cứu. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của luận án. Ý nghĩa thực tiễn. Đóng góp mới của luận án.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Vai trò của cytokine và interleukine 7 trong hệ miễn dịch ở người. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng các loại cytokine tái tổ hợp trong y học16 1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trên thế giới.

Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong nước. Một số hệ thống biểu hiện protein người tái tổ hợp. Hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp ở vi khuẩn. Dòng tế bào thuốc lá BY2 (Nicotiana tabacum Bright Yellow 2).

Hệ thống nuôi cấy rễ tơ thực vật. Cây chuyển gen biểu hiện cytokine tái tổ hợp. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Vật liệu thực vật.

Các chủng vi khuẩn. Các gen và vector. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu. Hóa chất và thiết bị máy móc.

Địa điểm và thời gian nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp thay đổi mã di truyền gen hIL-7 tối ưu biểu hiện protein ở thực vật. Thiết kế mồi.

Thiết kế vector chuyển gen mang gen hIL-7 tái tổ hợp. Phương pháp biểu hiện gen ở vi khuẩn, tạo dòng tế bào thuốc lá BY2, rễ tơ thuốc lá. Phân tích các chỉ tiêu sinh lý của dòng chuyển gen. Phân tích các dòng chuyển gen b ng k thuật sinh học phân tử.

Tinh sạch protein hIL-7 tái tổ hợp. Đánh giá hoạt tính protein hIL-7 tái tổ hợp. Phân tích thống kê kết quả thực nghiệm. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.

Thay đổi mã di truyền gen hIL-7 tối ưu biểu hiện ở thực vật. Thiết kế vector chuyển gen hIL-7 tái tổ hợp vào vi khuẩn, dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cây thuốc lá. Thiết kế vector chuyển gen pET32c(+)/IL7. Thiết kế vector chuyển gen pENTR221/cal/IL7.

Thiết kế vector chuyển gen pK7WG2D. Thiết kế vector chuyển gen pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong vi khuẩn.

Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng tế bào BY2. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng rễ tơ chuyển gen. Biểu hiện protein hIL-7 trong cây thuốc lá b ng Agro-infiltration. Đánh giá hoạt tính sinh học của protein hIL-7 tái tổ hợp.

Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong E. coli rosetta-gami B. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng tế bào BY-2, rễ tơ. Biểu hiện tạm thời protein hIL-7 tái tổ hợp ở cây thuốc lá.

Tăng cường biểu hiện protein ở thực vật với ELP và tinh sạch mITC. 113 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .109 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN110 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 145 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ký tự Tiếng Anh Tiếng Việt Acquired immunodeficiency Hội chứng suy giảm miễn dịch AIDS syndrome mắc phải ở người A. tumefaciens Agrobacteria tumefaciens A.

rhizogenes Agrobacteria rhizogenes AS Acetosyringone bp Base pairs Cặp bazơ BSA Bovine serum albumin Huyết thanh bò BY2 Bright yellow 2 Cal Calreticulin cDNA Complementary DNA ADN bổ sung Cetyl trimethyl Chất hoạt động bề mặt ammonium CTAB ammonium bromide bromide DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic dNTP Deoxyribo nucleotide triphosphate DTT Dithiothreitol E.Coli Escherichia coli EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Axit ethylenediaminetetraacetic Enzyme-linked K thuật phát hiện kháng nguyên, ELISA immunosorbent assay kháng thể trong mẫu xét nghiệm ELP Elastin-like peptide Cục quản lý thực phẩm và dược FDA Food & drug administration phẩm Hoa Kỳ Fibroblast growthfactor 8 Yếu tố tăng trưởng nguyên bào FGF8b isoform b sợi 8 isoform b hIL-7 Human interleukin 7 Interleukin 7 của người HEV Hepatitis E virus Virus viêm gan E ở người HPV Human papilloma virus Virus gây u nhú ở người HRP Horseradish peroxidase IFN Interferon IL Interleukin Immobilized metal ion affinity IMAC Sắc kí ion cố định kim loại chromatography Isopropyl β-D-1- IPTG thiogalactopyranoside kb Kilo base kDa Kilo danton đơn vị protein Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy LB Luria and Bertani vi khuẩn theo Luria và Bertani MHC Major histocompatibility complex Phức hệ phù hợp tổ chức Membrane-based inverse transition mITC Đảo ngược theo màng cycling mRNA ARN messenger ARN thông tin Môi trường dinh dưỡng cơ bản MS Murashige and Skoog nuôi cấy mô thực vật theo Murashige và Skoog NK cell Natural killer cell tế bào miễn dịch tự nhiên Neomycin phosphotransferase Gen kháng kháng sinh nptII II gen kanamycine OD Optical density Mật độ quang PBS Phosphate buffer saline dung dịch muối đệm phosphate PBST Phosphate buffer saline + tween 20 PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase PVDF Polyvinylidene difluoride Màng sử dụng trong western blot Ri - plasmid Hairy root inducing plasmid Plasmid gây bệnh rễ tơ ở thực vật RNAi RNA interference ARN can thiệp RNase Ribonuclease phân giải ARN Rpm Revolutions per minute Vòng/phút scFv Single-chain variable fragment SDS Sodium dodecyl sulfate Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE polyacrylamide gel electrophoresis siRNA small interfering RNA TAE Tris acetate EDTA TCR T-cell receptor Thụ thể kháng nguyên tế bào T T-DNA Transfer DNA Đoạn DNA chuyển vào thực vật TNF Tumor necrosis factor yếu tố hoại tử khối u TMB 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine UV Ultraviolet Tia tử ngoại vir Virulence region Vùng gây độc v/v Volume/volume thể tích/thể tích Môi trường nuôi cấy theo WPM Woody plant medium Mccown WT Wild type Chủng hoang dại w/v weight/volume khối lượng/thể tích YEB Yeast extract broth YMB Yeast malnitol broth v DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Phân nhóm IL ở người.2 Một số cytokine biểu hiện thành công ở tế bào BY2.3 Một số cytokine tái tổ hợp biểu hiện ở thực vật .1 Thống kê các trình tự mồi sử dụng trong luận án.2 Danh sách kháng sinh sử dụng trong luận án.3 Thành phần phản ứng LR.4 Thành phần gel SDS-PAGE.1 Xử lý mẫu protein với DTT.2 Kết quả tạo và chọn dòng tế bào BY2 mang gen hIL-7.3 Nồng độ DNA tổng số của 20 dòng tế bào BY2.4 Khối lượng tươi và khối lượng khô của một số dòng tế bào BY2.5 Kết quả chuyển gen pK7WG2D.1/cal/IL7 vào mô lá thuốc lá trên môi trường chọn lọc.6 Kết quả tạo dòng rễ tơ chuyển gen hIL-7.7 Đánh giá khối lượng tươi và khối lượng khô các dòng rễ tơ chuyển gen hIL-7.8 Đánh giá chiều dài một số dòng rễ tơ chuyển gen (cm).9 Hiệu suất thu hồi protein hIL-7 tái tổ hợp b ng phương pháp mITC.10 Kết quả hoạt hoá dòng tế bào 2E8 b ng protein hIL-7. 99 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Cấu trúc protein hIL-7.2 Thụ thể hIL-7.3 Vai trò của hIL-7.4 Dòng tế bào thuốc lá BY2 (Nicotiana Bright Yellow 2).1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát.2 Cấu trúc attL1_cal/SacI và HindIII/attL2 trong vector pENTR/cal.1 Sự phân bố tỷ lệ % phù hợp của các nhóm mã bộ ba gen hIL-7 biểu hiện trong hệ thống thực vật .2 Biểu đồ phân bố tần suất sử dụng codon theo chiều dài gen hIL-7 khi biểu hiện trong hệ thống thực vật.3 Trình tự gen hIL-7 trước và sau tối ưu mã di truyền.4 Cấu trúc vector pET32c(+)/IL7.5 Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen pET32c(+)/IL7.6 Cấu trúc vector pENTR221/cal/IL7.7 Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen pENTR221/cal/IL7.8 Kết quả colony PCR pK7WG2D.9 Kết quả cắt pK7WG2D.1/cal/IL7 b ng enzyme SacI và HindIII.10 Cấu trúc vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP.11 Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP.12 Kết quả điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP.13 Kết quả kiểm tra vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP b ng enzyme NcoI.14 Kết quả kiểm tra chủng biểu hiện pET32c(+)/IL7/Rosetta.15 Kết quả kiểm tra khả năng biểu hiện hIL-7 từ vi khuẩn E.coli Rosetta gami B nuôi ở 37oC và 28oC.16 Kiểm tra biểu hiện protein hIL-7 pha tan b ng Western blot.17 Kết quả kiểm tra colony PCR pK7WG2D.18 Chọn lọc dòng tế bào BY2 sau chuyển gen.19 Kết quả PCR các dòng BY2 chuyển gen b ng IL7_F và IL7_R.