Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu ứng dụng enzyme amylase, protease và nấm men thuần chủng sản xuất rượu vang nếp - Trường Đại học Trà Vinh

Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Rượu vang là loại thức uống được lên men từ nhiều nguồn liệu: nho, khóm, chuối, nếp… mang đậm đà bản sắc văn hóa dân tộc của từng địa phương. Từ xưa đến nay, rượu thường xuất hiện trong các lễ hội, đình đám, các cuộc gặp gỡ của người thân, bạn bè. Rượu được sử dụng với nhiều mục đích ý nghĩa khác nhau như để chúc mừng, nâng cao sức khỏe hay để giải bày tâm sự… Rượu trở thành một trong những thức uống không thể thiếu trong văn hóa ẩm thực cũng như trong đời sống hằng ngày. Ngày nay với sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, nhiều sản phẩm lên men truyền thống đã được nghiên cứu sâu về mặt quy trình sản xuất, hiện nay ở các nước trong khu vực đã nghiên cứu, cải tiến thành công chất lượng rượu cổ truyền và được áp dụng sản xuất với qui mô công nghiệp, phân phối rộng rãi trên thế giới như rượu Sakê của Nhật, rượu Mao Đài của Trung Quốc, rượu Shochu ở Hàn Quốc.

Ở Việt Nam thức uống lên men truyền thống cũng rất đa dạng từ: rượu nho, rượu Cần ở các dân tộc miền núi Tây Nguyên đến rượu nếp của người Kinh, nhiều địa phương đã sản xuất các loại rượu nổi tiếng như rượu Làng Vân ở miền Bắc và rượu Gò Đen, Phú Lễ, Xuân Thạnh ở miền Nam được nhiều người ưa chuộng. Trong các loại rượu cổ truyền kể trên thì rượu nếp là một loại khá đặc biệt, sản phẩm là kết quả của quá trình lên men từ những hạt nếp mà thành. Tuy nhiên, phương pháp sản xuất rượu ở một số địa phương vẫn còn theo phương pháp cổ truyền, tức là quá trình đường hóa và lên men được thực hiện bởi nấm mốc và nấm men trong bánh men thuốc bắc và thiết bị sản xuất thô sơ, nên năng suất chưa cao và chất lượng chưa an toàn vì chứa nhiều độc tố, tạp chất ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng. Do đó, để nâng cao hơn nữa chất lượng sản phẩm truyền thống này chúng tôi đề ra quy trình sản xuất rượu theo phương pháp mới, thông qua kết hợp hài hòa giữa công nghệ cổ truyền và kỹ thuật hiện đại.

Với việc ứng dụng phương pháp enzyme và nấm men thuần chủng ở giai đoạn đường hóa, thủy phân protein và lên men để rút ngắn thời gian sản xuất cũng như ổn định được chi phí sản xuất, đảm bảo chất lượng và an toàn vệ sinh thực phẩm của sản phẩm rượu vang nếp. Từ những lý do trên việc nghiên cứu “Hoàn thiện quy trình sản xuất rượu vang nếp trắng bằng enzyme và nấm men thuần chủng” có ý nghĩa rất quan trọng.2 Mục tiêu của đề tài Xây dựng qui trình sản xuất rượu nếp sạch theo tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm TCVN 7045: 2009. Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 1 Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh Cải thiện quy trình sản xuất rượu nếp truyền thống theo phương pháp cổ truyền có thể sản xuất công nghiệp và cho ra sản phẩm chất lượng cao và an toàn về mặt vệ sinh thực phẩm.3 Nội dung nghiên cứu Từ những mục tiêu trên, đề tài tiến hành các khảo sát sau: - Khảo sát ứng dụng enzyme α-amylase trong quá trình dịch hóa và đường hóa một phần hồ tinh bột nếp trắng. - Khảo sát ứng dụng enzyme glucoamylase trong quá trình đường hóa dịch nếp trắng.

- Khảo sát động học và ứng dụng enzyme papain trong quá trình thủy phân protein của dịch nếp trắng. - Khảo sát động học và ứng dụng enzyme bromelain trong quá trình thủy phân protein của dịch nếp trắng. - Theo dõi, so sánh, đánh giá chất lượng sản phẩm rượu lên men truyền thống sử dụng men thuốc bắc và rượu sử dụng enzyme với nấm men thuần chủng trong giai đoạn lên men chính và ổn định. - Đánh giá chất lượng sản phẩm (cảm quan, hóa lí và vi sinh vật) - Phân tích kết quả và tìm ra qui trình sản xuất tối ưu cho sản phẩm rượu vang nếp.

Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 2 Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Nguồn nguyên liệu sản xuất rượu Tên khoa học của nếp là Oryza Sativa thuộc nhóm ngũ cốc, là loại nguyên liệu chứa tinh bột rất cao phù hợp với công nghệ lên men, trong đó nếp trắng với hàm lượng tinh bột lên đến hơn 70%, vì vậy nếp trắng được sử dụng rộng rãi trong công nghệ sản xuất rượu.1 Hạt nếp trắng Trong tinh bột bao gồm hai thành phần: amylose và amylopectin, 2cấu tử này khác hẳn về tính chất hoá học và tính chất vật lý. Phân tử amylose tạo màu xanh với iod còn amylopectin cho m àu tím đỏ, amylose và amylopectin cũng khác nhau về tính hoà tan, amylose dễ hoà tan trong nước ấm và tạo nên dung dịch có độ nhớt không cao, còn amylopectin chỉ hoà tan khi đun nóng và tạo nên dung dịch có độ nhớt cao. Trong phân tử tinh bột tỉ lệ giữa amylose và amylopectin thay đổi tuỳ thuộc vào nguồn nguyên liệu, trong hạt gạo chủ yếu là amylose, còn trong hạt nếp là amylopectin.1 Thành phần hóa học của nguyên liệu nếp trắng Thành phần Hàm lượng (%) Nước 14,0 Protein 8,2 Lipid 1,5 Glucid 74,9 Acid hữu cơ 0,6 Tro 0,8 (Nguyễn Đức Lượng, 2003) Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 3 Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh + Amylose có trọng lượng phân tử từ 50.000, được cấu tạo từ 200 ÷ 1.000 phân tử D-glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,4 glycoside tạo thành mạch xoắn dài không phân nhánh. + Amylopectin có trọng lượng phân tử khoảng 400.000, được cấu tạo từ 600 ÷ 6.000 phân tử D-glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,4 glycoside và α-1,6 glycoside tạo thành mạch phân nhánh.2 Enzyme amylase Enzyme amylase là một trong số các hệ enzyme được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp, y học, thực phẩm và nhiều lĩnh vực khác, amylase thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác sự phân giải các liên kết glycoside nội phân tử trong các polysaccharides.

Enzyme amylase sẽ thủy phân tinh bột, glycogen và các dextrin mạch dài thành glucose, maltose và dextrin mạch ngắn. Dựa vào đặc tính và cơ chế tác dụng lên phân tử tinh bột của enzyme amylase, người ta phân biệt chia enzyme amylase thành hai nhóm: - Endoamylase (enzyme nội phân): gồm α-amylase và nhóm enzyme khử mạch nhánh.2 Cơ chế tác dụng của enzyme amylase lên phân tử tinh bột 2.1 Enzyme α-amylase (EC 3.1) Đặc tính: Enzyme α-amylase dễ tan trong nước, các dung dịch muối và rượu loãng. Protein của các α-amylase có tính acid yếu. Protein của α-amylase từ các nguồn sản Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 4 Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh xuất có thành phần amino acid khác nhau.

Điều kiện hoạt động và độ bền của các enzyme α-amylase tùy thuộc vào nguồn chiết suất.2 Điều kiện hoạt động của enzyme α-amylase từ các nguồn khác nhau Nguồn gốc pH tối thích Nhiệt độ tối thích (0C) Malt 5,5 ÷ 5,7 72 ÷ 75 Vi khuẩn 5,0 ÷ 6,0 50 ÷ 60 Nấm mốc 6,0 ÷ 7,0 60 ÷ 70 (Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2004) Ion Ca2+ là một trong những thành phần quan trọng tham gia vào việc hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme α-amylase, đồng thời nó còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzyme α-amylase khi bị tác động của các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme thủy phân protein, nếu α-amylase bị mất ion Ca2+ thì nó hoàn toàn bị mất khả năng thủy phân cơ chất. Enzyme α-amylase được hoạt hóa bởi các ion đơn hóa trị như: Cl- > Br- > I-. Đồng thời chúng bị kìm hãm bởi ion kim loại nặng như: Cu2+, Hg2+ (Shahina Naz, 2002). Enzyme α-amylase kém bền trong môi trường acid nhưng khá bền ở môi trường nhiệt Bảng 2.3 Khả năng chịu nhiệt của α-amylase từ các nguồn sản xuất khác nhau Hoạt tính (% so với hoạt tính ban đầu) Nhiệt độ (0C) Malt Nấm mốc Vi khuẩn 65 100 100 100 70 100 52 100 75 58 3 100 80 25 - 92 85 1 - 58 90 - - 52 (Nguyễn Đức Lượng, 2004) * Cơ chế tác dụng lên mạch amylose và amylopectin Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 5 Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh Enzyme α-amylase có khả năng phân cắt liên kết 1,4 α-glycoside ở bất kỳ vị trí nào trên mạch tinh bột đã được hồ hóa.

Do đó, enzyme này được gọi là enzyme nội phân (endo).3 Cấu trúc không gian của enzyme α-amylase Giai đoạn dextrin hóa (dịch hóa): Dưới tác dụng của α-amylase, phân tử amylose bị phân cắt thành các oligosaccharides (6 ÷7 gốc glucose), độ nhớt của hồ tinh bột rất giảm nhanh. Giai đoạn đường hóa: Các oligosaccharides lại tiếp tục bị phân cắt tạo thành maltotriose, maltose. Sau thời gian tác dụng dài, sản phẩm của quá trình thủy phân α- amylase là 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của enzyme α-amylase trên amylopectin cũng xảy ra tương tự và sản phẩm được tạo thành là 72% maltose và 19% glucose, ngoài ra còn có các dextrin phân tử thấp và isomaltose (8%) do α-amylase không cắt được liên kết 1, 6-glycoside ở mạch nhánh của phân tử amylopectin.4 Tác dụng của α-amylase lên phân tử amylose và amylopectin Đề tài nghiên cứu sẽ đề cập đến việc sử dụng Chế phẩm enzyme Termamyl 120L: ở dạng lỏng, chứa enzyme có khả năng chịu nhiệt ổn định α-amylase, được sản xuất từ một chủng loại vi sinh vật chọn lọc tên là Bacillus licheniformis.

Enzyme α-amylase nội bào phân cắt các liên kết α-1, 4-glucoside nằm ở bên trong phân tử cho ra dextrin và các oligosaccharides. Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 6 Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh Trong dịch tinh bột hòa tan Termamyl 120L có hoạt tính 120 KNU/g (Kilo Novo α- amylase unit). Hoạt tính có thể bị hủy bằng xử lý nhiệt dung dịch ở pH thấp. Sản phẩm này không dễ bắt lửa, tan hoàn toàn trong nước và an toàn khi sử dụng theo như chỉ dẫn, sản phẩm Termamyl 120L có thể gây dị ứng đối với người nhạy cảm (Novo Nordisk, 2007).2 Enzyme glucoamylase (EC 3.3) Đặc tính: Glucoamylase là một exoamylase, còn được gọi là γ-amylase amyloglucosidae, có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột (Shahina Naz, 2002).

So với β-amylase, γ-amylase bền với acid hơn nhưng lại kém bền dưới tác dụng của ethylic, acetone, không bền với ion Cu2+, Hg2+… Glucoamylase có trong nấm mốc và một vài loại vi khuẩn, hoạt động tốt ở 500C, hoạt lực tối đa trong vùng pH: 4,5 ÷ 5,5.