Luận án nghiên cứu hệ gen ty thể, đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi họ Paragonimidae tại Việt Nam và một số khu vực châu Á

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Thị Khuê NGHIÊN CỨU HỆ GEN TY THỂ, ĐƠN VỊ MÃ HÓA RIBOSOME CỦA SÁN LÁ PHỔI HỌ PARAGONIMIDAE TẠI VIỆT NAM VÀ MỘT SỐ KHU VỰC Ở CHÂU Á LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Thị Khuê NGHIÊN CỨU HỆ GEN TY THỂ, ĐƠN VỊ MÃ HÓA RIBOSOME CỦA SÁN LÁ PHỔI HỌ PARAGONIMIDAE TẠI VIỆT NAM VÀ MỘT SỐ KHU VỰC Ở CHÂU Á Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã sỗ: 9 42 01 16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. Đoàn Thị Thanh Hương Hà Nội – 2022 i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: - GS. Lê Thanh Hoà, nguyên Trưởng Phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người thầy rất tâm huyết đã tận tình trực tiếp hướng dẫn, định hướng nghiên cứu, đã tạo điều kiện tối đa và truyền dạy kiến thức, kinh nghiệm, động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Đoàn Thị Thanh Hương, Trưởng phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là người thầy, người chị đã tận tình chỉ dạy và đồng hướng dẫn khoa học tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới các đồng nghiệp Phòng Miễn dịch học và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận án của mình. Tôi xin trân trọng cảm ơn: - Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu. - Ban Giám đốc, Khoa Công nghệ sinh học, Phòng Quản lý Đào tạo - Học viện Khoa học và Công nghệ đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập. - Cám ơn sự hỗ trợ kinh phí của Quỹ Phát triển Khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 108.TS Lê Thanh Hòa chủ nhiệm.

Đặng Tất Thế, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; GS. Takeshi Agatsuma, Trường Đại học Kochi, Nhật Bản; GS. David Blair; GS. Nguyễn Văn Đề, Trường Đại học Y Hà Nội và PGS.

Phạm Ngọc Doanh, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã giúp đỡ hợp tác trao đổi thu mẫu, thí nghiệm nghiên cứu hình thái học cho nghiên cứu này và các giúp đỡ khác ii trong công bố và hoàn thành luận án. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình đã luôn là chỗ dựa vững chắc, giúp đỡ cũng như chia sẻ những khó khăn cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn chồng và các con của tôi đã luôn khuyến khích và truyền nhiệt huyết cho tôi thêm sức mạnh để giúp tôi hoàn thành quá trình học tập và nghiên cứu của mình. Hà Nội, ngày 13 tháng 5 năm 2022 Tác giả Nguyễn Thị Khuê iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác; Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày 13 tháng 5 năm 2022 Tác giả Nguyễn Thị Khuê iv MỤC LỤC Tr Lời cảm ơn. i Lời cam đoan.iii Mục lục. iv Danh mục các chữ viết tắt. viii Danh mục các bảng.

xi Danh mục các hình. xiii MỞ ĐẦU. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.1 Tình hình nghiên cứu sán lá phổi họ Paragonimidae.1 Phân loại sán lá phổi họ Paragonimidae.2 Phân bố địa lý sán lá phổi họ Paragonimidae.3 Đặc điểm sinh học sán lá phổi họ Paragonimidae.4 Tình hình nghiên cứu sán lá phổi họ Paragonimidae trên thế giới.5 Tình hình nghiên cứu sán lá phổi họ Paragonimidae ở Việt Nam.2 Giới thiệu ty thể, ribosome của ty thể và hệ gen ty thể.1 Giới thiệu ty thể, nguồn gốc, cấu tạo và chức năng.2 Cấu trúc và sắp xếp gen ở hệ gen ty thể.3 Mitoribosome của ty thể và thành phần cấu tạo.4 Đặc điểm gen học hệ gen ty thể.3 Cấu trúc đơn vị mã hóa ribosome của hệ gen nhân.1 Cấu trúc ribosome của tế bào.2 Đơn vị mã hóa ribosome của hệ gen nhân tế bào.3 Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử của đơn vị mã hóa ribosome.4 Sự cần thiết nghiên cứu đặc điểm gen hệ gen ty thể và đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi Paragonimus ………………………. ĐỐI TƯƠNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 2.1 Đối tượng, mục tiêu, nội dung và địa điểm nghiên cứu.1 Đối tượng nghiên cứu ……………………………………………………….2 Mục tiêu nghiên cứu.3 Nội dung nghiên cứu ……………………………………….4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu.

Vật liệu nghiên cứu ………………………………………………….1 Nguồn vật liệu là mẫu sán lá phổi nghiên cứu.2 Vật liệu khuôn DNA và các loại mồi sử dụng.3 Hóa chất, sinh phẩm, dụng cụ.4 Trang thiết bị.3Phương pháp nghiên cứu gen và hệ gen ty thể (mtDNA) ……….1 Phương pháp xác định cấu trúc và sắp xếp gen ở hệ gen ty thể của sán lá phổi Paragonimus heterotremus và P.2 Phương pháp phân tích đặc điểm gen RNA ribosome ty thể (MRG)….3 Phương pháp phân tích đặc điểm gen RNA vận chuyển ty thể (tRNA) .4 Phương pháp phân tích vùng không mã hóa ở hệ gen ty thể ………….5 Phân tích phương thức sử dụng nucleotide và tính toán giá trị độ lệch (skew/skewness) trong hệ gen ty thể ……………………………………….6 Phương pháp tính khoảng cách di truyền giữa các loài sán lá phổi dựa trên chuỗi nucleotide của hệ gen ty thể …………………………………….7 Phương pháp phân tích đặc điểm gen mã hóa protein và sự “thiên vị” sử dụng bộ mã ………………………………………………………………… 51 2.8 Phương pháp phân tích phả hệ dựa trên chỉ thị cộng hợp toàn bộ 12 PCG của mtDNA …………………………………………………………….4 Phương pháp nghiên cứu gen học đơn vị mã hóa ribosome (rTU).1 Phương pháp xác định cấu trúc và sắp xếp gen ở đơn vị mã hóa ribosome của Paragonimus heterotremus và sán lá phổi châu Á ……… 53 2.2 Phương pháp xác định độ dài, đặc điểm gen/vùng giao gen ở đơn vị mã hóa ribosome …………………………………………………………….3 Phương pháp phân tích đặc điểm cấu trúc bậc hai gen 18S và 28S rRNA của Paragonimus heterotremus và P.4 Phương pháp phân tích đặc điểm cấu trúc bậc hai vùng giao gen (ITS-1 và ITS-2) của Paragonimus heterotremus và sán lá phổi châu Á …….5 Phương pháp phân tích phương thức sử dụng nucleotide và giá trị độ lệch (“skew”) trong đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi châu Á ….6 Phương pháp phân tích tương đồng nucleotide của gen 18S+28S rRNA và phần mã hóa ribosome (rTU*) của sán lá phổi họ Paragonimidae ….7 Phương pháp xác lập phả hệ dựa trên phân tích chuỗi gen 28S rRNA toàn phần (~3,8 kb) …………………….8 Phương pháp xác lập phả hệ dựa trên phân tích cộng hợp chuỗi gen 18S+28S rRNA toàn phần (~5,8 kb)……………………. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ……………………………………….1 Kết quả nghiên cứu đặc điểm hệ gen ty thể của sán lá phổi châu Á vi Paragonimus heterotremus và P. ohirai họ Paragonimidae ……….1 Cấu trúc và sắp xếp hệ gen ty thể của sán lá phổi Paragonimus heterotremus (mẫu Việt Nam) và P.2 Phân tích đặc điểm và cấu trúc gen RNA ribosome của ty thể (MRG)….3 Phân tích đặc điểm và cấu trúc gen RNA vận chuyển ty thể (tRNA)…….4 Phân tích vùng không mã hóa (NCR) ở hệ gen ty thể của P.5 Phương thức sử dụng nucleotide và giá trị “độ lệch” (skew) trong hệ gen ty thể của P. ohirai và sán lá phổi khác …….6 Phân tích đặc điểm gen mã hóa protein và sự “thiên vị” sử dụng bộ mã ở hệ gen ty thể của P.

ohirai và sán lá phổi châu Á ….7 Khoảng cách di truyền giữa P. heterotremus và các loài sán lá phổi châu Á dựa trên chuỗi nucleotide phần mã hóa của hệ gen ty thể …….8 Phân tích phả hệ sán lá phổi họ Paragonimidae dựa trên dữ liệu amino acid cộng hợp của 12 PCG ………………………………. Kết quả nghiên cứu đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi họ Paragonimidae ……………………………………………………….1 Cấu trúc và sắp xếp gen ở đơn vị mã hóa ribosome của các loài sán lá phổi Paragonimus châu Á (P.2 Độ dài gen rRNA và vùng giao gen ở đơn vị mã hóa ribosome của các loài sán lá phổi Paragonimus châu Á ……………………………………… 83 3.3 Đặc điểm cấu trúc gen rRNA (18S và 28S rRNA) của loài P.4 Đặc điểm cấu trúc vùng giao gen (ITS-1 và ITS-2) của loài P.5 Kết quả phân tích phương thức sử dụng nucleotide và giá trị “độ lệch” (skew) ở đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi châu Á ……………… 92 3.6 Kết quả phân tích tương đồng nucleotide của các gen rRNA và phần mã hóa ribosome của sán lá phổi họ Paragonimidae …………………… 94 3.7 Phân tích phả hệ sán lá phổi họ Paragonimidae dựa trên dữ liệu đơn gen 28S rRNA toàn phần …………………………………………………….8 Phân tích phả hệ sán lá phổi họ Paragonimidae dựa trên dữ liệu cộng hợp gen 18S+28S rRNA toàn phần ………………………………………… 98 CHƯƠNG 4.1 Về nghiên cứu gen/hệ gen ty thể của sán lá phổi Paragonimus vii heterotremus và Paragonimus ohirai ……………………………….1 Về thu nhận dữ liệu gen/hệ gen ty thể của Paragonimus heterotremus và Paragonimus ohirai …………………………………………………… 103 4.2 Về đặc điểm cấu trúc của gen và hệ gen ty thể sán lá phổi Paragonimus heterotremus và Paragonimus ohirai…………………….3 Về đặc điểm thành phần gen ty thể của sán lá phổi Paragonimus heterotremus và Paragonimus ohirai……………………………………… 109 4.4 Về ứng dụng mtDNA trong nghiên cứu phân loại và phả hệ tiến hóa của sán lá phổi châu Á ……………………………………………………….5 Về xây dựng cơ sở dữ liệu mtDNA của họ Paragonimidae. Về nghiên cứu đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi châu Á ….1 Về thu nhận dữ liệu gen/vùng giao gen của đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi châu Á ……………………………………………………….2 Về đặc điểm cấu trúc của gen rRNA và vùng giao gen ở đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi châu Á …………………………………………… 120 4.3 Về đặc điểm thành phần gen của đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi châu Á …………………………………………………………………….4 Về ứng dụng đơn vị mã hóa ribosome trong nghiên cứu phân tích phả hệ 123 4.5 Về xây dựng cơ sở dữ liệu đơn vị mã hóa ribosome của họ Paragonimidae 124 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.