Luận án TS Dược học: Thành phần hóa học, chất đối chiếu & kiểm nghiệm Trinh nữ hoàng cung

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ***** NGUYỄN HỮU LẠC THỦY NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM THÀNH PHẦN ALCALOID VÀ FLAVONOID CHO CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG (Crinum latifolium L., Amaryllidaceae) LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Tp Hồ Chí Minh – Năm 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MIINH NGUYỄN HỮU LẠC THỦY NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM THÀNH PHẦN ALCALOID VÀ FLAVONOID CHO CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG (Crinum latifolium L., Amaryllidaceae) Chuyên ngành: KIỂM NGHIỆM THUỐC Mã số: 62.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS. VÕ THỊ BẠCH HUỆ Tp Hồ Chí Minh – Năm 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả được trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Người cam đoan, Nguyễn Hữu Lạc Thủy i MỤC LỤC MỤC LỤC.

i BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT .iii DANH MỤC HÌNH ẢNH. v DANH MỤC BẢNG BIỂU. vii DANH MỤC SƠ ĐỒ. vii ĐẶT VẤN ĐỀ.

1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Tổng quan thực vật học cây Trinh nữ hoàng cung. Tổng quan hóa học của chi Crinum và cây Trinh nữ hoàng cung. Tổng quan tác dụng sinh học chi Crinum và cây Trinh nữ hoàng cung.

Chiết hoạt chất từ dược liệu bằng dung môi CO2 lỏng siêu tới hạn. Các phương pháp nghiên cứu hóa học của cây Trinh nữ hoàng cung. Phương pháp thiết lập chất đối chiếu. 24 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

Nguyên vật liệu. Trang thiết bị. Phương pháp nghiên cứu. 29 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.

Quy trình chiết cao cồn, phân đoạn alcaloid và phân đoạn flavonoid từ cây Trinh nữ hoàng cung. Phân lập hợp chất tinh khiết. Thiết lập chất đối chiếu. Xây dựng phương pháp HPLC, CE, dấu vân tay để định tính và định lượng alcaloid hoặc flavonoid trong lá TNHC.

Đề xuất một số chỉ tiêu cần thiết để xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm bột lá Trinh nữ hoàng cung. 99 ii CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN. Các phương pháp chiết xuất hoạt chất từ cây Trinh nữ hoàng cung. Phân lập hợp chất tinh khiết.

Thiết lập chất đối chiếu từ cao chiết Trinh nữ hoàng cung. Quy trình định lượng alcaloid và flavonoid từ lá Trinh nữ hoàng cung. Các chỉ tiêu cần thiết của Tiêu chuẩn kiểm nghiệm TNHC. 117 KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ DANH MỤC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHẦN PHỤ LỤC iii BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT ASEAN Association of Southeast Asian Nations (Hiệp hội các quốc gia Đông Nam Á) AL-NK Phân đoạn alcaloid chiết từ lá TNHC bằng phương pháp ngấm kiệt AL-SA Phân đoạn alcaloid chiết từ lá TNHC bằng sóng siêu âm AL-SFE Phân đoạn alcaloid chiết từ lá TNHC bằng phương pháp SFE AR-96 Phân đoạn alcaloid chiết từ rễ TNHC với dung môi cồn 96% As Hệ số bất đối CĐC Chất đối chiếu CE Caplillary Electrophoresis (Điện di mao quản) Corr Area Corrected Area (Diện tích pic được chuẩn hóa) CZE Caplillary Zone Electrophoresis (Điện di mao quản vùng) d doublet (đỉnh đôi) DĐVN IV Dược điển Việt Nam xuất bản lần thứ IV DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DSC Differential Scanning Calorimetry (Nhiệt vi sai) DMSO Dimethylsulfoxyd DVT Dấu vân tay ESI Electrospray Ionization (Ion hóa bằng cách phun ion) FL-NK Phân đoạn flavonoid chiết từ lá TNHC bằng phương pháp ngấm kiệt FL-SA Phân đoạn flavonoid chiết từ lá TNHC bằng sóng siêu âm FL-SFE Phân đoạn flavonoid chiết từ lá TNHC bằng phương pháp SFE FR-96 Phân đoạn flavonoid chiết từ rễ TNHC với dung môi cồn 96% GC Gas Chromatography (Sắc ký khí) GC-MS Gas Chromatography – Mass Spectrometry (Sắc ký khí ghép khối phổ) GLP Good Laboratory Practices (Thực hành tốt phòng kiểm nghiệm thuốc) HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation IR Infrared (Hồng ngoại) iv J Coupling constant (Hằng số ghép) LC-MS Liquid Chromatography – Mass Spectrometry (Sắc ký lỏng ghép khối phổ) L-SFE Cao toàn phần chiết từ lá TNHC bằng phương pháp SFE MEKC Micellar Electrokinetic Chromatography (Sắc ký mixen điện động) MS Mass Spectrometry (Khối phổ) NMR Nuclear Magnetic Resonance (Cộng hưởng từ hạt nhân) PĐ Phân đoạn PDA Photo Diode Array (Dãy diod quang) PCRS Primary Chemical Reference Standard (Chất đối chiếu hóa học sơ cấp) PTN Phòng thí nghiệm RSD Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) Rs độ phân giải giữa pic có thời gian lưu nhỏ và lớn hơn kề bên S Diện tích pic (µV x giây) s singlet (Đỉnh đơn) SKĐ Sắc ký đồ SCRS Secondary Chemical Reference Standard (Chất đối chiếu hóa học thứ cấp) SDS Sodium Dodecyl Sulfate SFE Supercritical Fluid Extraction (Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn) SKLM Sắc ký lớp mỏng TCKN Tiêu chuẩn kiểm nghiệm TR Thời gian lưu (phút) TM Thời gian di chuyển (phút) TNHC Trinh nữ hoàng cung TGA Thermogravimetric Analysis (Phân tích nhiệt trọng lượng) TT Thuốc thử UV-Vis Ultraviolet-Visible (Tử ngoại khả kiến) VLC Vacuum Liquid Chromatography (Sắc ký cột chân không) v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Hình vẽ cây TNHC .2: Các cấu trúc hóa học của alcaloid khung crinin .3: Cấu trúc hóa học alcaloid khung lycorin (A) và khung tazettin (B) .4: Cấu trúc hóa học khung belladin (C) và cấu trúc khung galanthamin (D) 7 Hình 1.5: Cấu trúc hóa học khung lycorenin (E) và cấu trúc khung cheryllin (F) .6: Cấu trúc hóa học của các flavonoid trong chi Crinum .7: Cấu trúc hóa học các hợp chất flavonoid trong cây TNHC .1: Hình lá và cụm hoa của cây TNHC (Crinum latifolium L.2: Hình hoa Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.3: SKĐ các hợp chất phân lập từ các phân đoạn alcaloid.4: SKĐ các hợp chất phân lập từ phân đoạn alcaloid AR và flavonoid.5: Cấu trúc hóa học và dữ liệu phổ NMR (500 MHz, CDCl3) của (2).6: Cấu trúc hóa học của 6-ethoxyundulatin.7: SKĐ xác định độ tinh khiết của CĐC crinamidin bằng HPLC.8: SKĐ xác định độ tinh khiết CĐC 6-hydroxycrinamidin HPLC.9: SKĐ xác định độ tinh khiết của CĐC lycorin bằng HPLC.10: SKĐ xác định độ tinh khiết của CĐC hippadin bằng HPLC.11: SKĐ xác định độ tinh khiết của CĐC astragalin bằng HPLC.12: SKĐ xác định độ tinh khiết của CĐC isoquercitrin bằng HPLC.13: Các SKĐ thẩm định tính đặc hiệu trong quy trình định lượng đồng thời 6 alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC.14: Các SKĐ thẩm định tính đặc hiệu trong quy trình định lượng đồng thời astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC.15: Các điện di đồ thẩm định tính đặc hiệu của quy trình định lượng đồng thời 6 alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp CE.16: Các điện di đồ thẩm định tính đặc hiệu của quy trình định lượng đồng thời astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng phương pháp CE.17: Sắc ký đồ DVT – SKLM alcaloid TNHC.18: Sắc ký đồ DVT – SKLM flavonoid TNHC.1: SKĐ alcaloid TNHC bằng HPLC, kỹ thuật rửa giải isocratic.2: SKĐ alcaloid TNHC bằng HPLC, kỹ thuật rửa giải gradient.3: Điện di đồ so sánh mẫu thử alcaloid phân tích bằng CZE và MEKC.4: Điện di đồ mẫu thử alcaloid pha trong methanol.5: Điện di đồ mẫu thử alcaloid pha trong đệm dinatri tetraborat 25 mM.6: Điện di đồ mẫu thử alcaloid pha trong dung dịch acid H3PO4.7: SKĐ so sánh khả năng rửa giải mẫu flavonoid TNHC bằng HPLC với pha động methanol và acetonitril .1 Sơ đồ khảo sát quy trình chiết hoạt chất từ cây TNHC.2 Sơ đồ khảo sát chiết hoạt chất từ lá TNHC kết hợp hai phương pháp SFE và phương pháp chiết ngấm kiệt với cồn 70%.1 Sơ đồ chiết cao cồn, PĐ alcaloid và PĐ flavonoid từ lá TNHC .2 Sơ đồ chiết alcaloid và flavonoid từ rễ TNHC.3 Sơ đồ chiết alcaloid và flavonoid bột lá kết hợp hai phương pháp chiết.4 Sơ đồ phân lập hợp chất (2) và (3) từ PĐ alcaloid AL-SFE.5 Sơ đồ chiết alcaloid AL-SA hoặc flavonoid FL-SA.

82 vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Alcaloid của TNHC Crinum latifolium L.1: Hiệu suất chiết (%) hoạt chất bằng phương pháp ngấm kiệt.2: Kết quả khảo sát ảnh hưởng thời gian lên hiệu suất chiết.3: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của áp suất lên hiệu suất chiết.4: Kết quả tách phân đoạn mẫu AL-SFE và FL-NK bằng VLC.5: Các hợp chất tinh khiết phân lập được từ cao chiết TNHC.6: Kết quả phân lập alcaloid từ phân đoạn ALS1.7: Kết quả triển khai sắc ký cột với chất hấp phụ pha đảo.8: Kết quả phân lập (2) và (3) từ PĐ n–hexan.9: Kết quả phân lập các (8), (9), (10) từ PĐ alcaloid AL-NK.10: Dữ liệu phổ NMR (Máy 500 MHz, CDCl3) của hợp chất (2).11: Các tương tác proton trên phổ COSY, HMBC của hợp chất (2).12: Kết quả độ tinh khiết; hàm ẩm bằng phân tích nhiệt trọng lượng.13: Thành phần pha động và bước sóng phát hiện của quy trình xác định độ tinh khiết của các nguyên liệu CĐC bằng phương pháp HPLC.14: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống quy trình phân tích HPLC.15: Kết quả xác định độ tinh khiết sắc ký (%) các CĐC bằng HPLC.16: Dữ liệu phổ UV-Vis, MS và điểm chảy của các CĐC.17: Dữ liệu phổ IR của các CĐC.18: Kết quả đánh giá đồng nhất lô của các CĐC sau khi đóng gói.19: Kết quả phân tích robust A của CĐC crinamidin.20: Kết quả phân tích robust A của CĐC 6-hydroxycrinamidin.21: Kết quả phân tích robust A của CĐC hippadin.22: Kết quả phân tích robust A của CĐC lycorin.23: Kết quả phân tích robust A của CĐC astragalin.24: Kết quả phân tích robust A của CĐC isoquercitrin.25: Kết quả xác định giá trị ấn định và giá trị công bố các CĐC.26: Chương trình dung môi định lượng 6 alcaloid bằng HPLC.27: Kết quả khảo sát tình phù hợp hệ thống của quy trình định lượng đồng thời 6 alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 6).28: Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian trong quy trình định lượng đồng thời 6 alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 6).29: Kết quả khảo sát tỷ lệ phục hồi của quy trình định lượng đồng thời 6 alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 9).30: Kết quả khảo sát tình phù hợp hệ thống của quy trình đinh lượng đồng thời astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 6).31: Kết quả khảo sát độ chính xác của quy trình định lượng đồng thời astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng HPLC (n = 6).32: Kết quả khảo sát độ đúng của quy trình định lượng đồng thời astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 9).33: Kết quả khảo sát tình phù hợp hệ thống quy trình định lượng đồng thời 6 alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp CE (n = 6).