Luận án tiến sỹ hoàn chỉnh kiểm nghiệm nghiên cứu chiết xuất và tinh chế conessi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOBỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ CONESSIN, KAEMPFEROL, NUCIFERIN TỪ DƯỢC LIỆU LÀM CHẤT CHUẨN ĐỐI CHIẾU TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO BỘ Y TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ CONESSIN, KAEMPFEROL, NUCIFERIN TỪ DƯỢC LIỆU LÀM CHẤT CHUẨN ĐỐI CHIẾU TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC Người hướng dẫn khoa HÀ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kì công trình nào khác. LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới: PSG. Thái Nguyễn Hùng Thu PGS.

Trịnh Văn Lẩu những người thầy đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án này. Tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ quí báu của PGS. Nguyễn Viết Thân, PGS.TS Nguyễn Thái An, Bộ môn Dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội, đã giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu tìm hiểu và khảo sát các phương pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế các hợp chất tự nhiên từ dược liệu. Tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ quí báu của TS.

Trần Việt Hùng, ThS. Nguyễn Thị Kim Thanh,TS. Trần Thị Hồng Anh, ThS. Vũ Thị Nguyệt Minh và các bạn đồng nghiệp tại Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình xây dựng bộ dữ liệu chuẩn, xây dựng phương pháp phân tích và đánh giá liên phòng thí nghiệm.

Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Trần Tử An, đã giới thiệu đề tài nghiên cứu và dành cho tôi nhiều ý kiến trao đổi khoa học thú vị trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Trần Đức Hậu, PGS.TSKH Lê Thành Phước, đã đóng góp cho tôi nhiều nhận xét bổ ích trong quá trình hoàn thành bản luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn DS. Dương Văn Tú, Bộ môn Bào chế, Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp tôi tìm được nhiều tài liệu tham khảo có giá trị.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội, Phòng Sau đại học, Bộ môn Hóa phân tích đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ Bộ môn Hóa đại cương – vô cơ đã giúp đỡ tôi trong quá trình vừa công tác vừa thực hiện luận án. Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên tôi trong suốt thời gian qua. Một lần nữa, tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới tất cả sự giúp đỡ quí báu trên.

MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. Xu thế phát triển thuốc có nguồn gốc thiên nhiên 3 1. Tổng quan về các đối tượng nghiên cứu 7 1. Về hợp chất Conessin và cây Mức hoa trắng 7 1.

Về hợp chất Kaempferol và cây Đơn lá đỏ 12 1. Về hợp chất Nuciferin và cây Sen 16 1. Phương pháp thiết lập chất chuẩn đối chiếu từ dược liệu 22 1. Phương pháp thiết lập chất chuẩn đối chiếu 22 1.

Hoạt động thiết lập chất chuẩn đối chiếu của các Hội đồng Dược điển, của khu vực ASEAN và Việt Nam 29 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2. Nguyên liệu nghiên cứu 33 2. Hóa chất, thuốc thử 34 2.

Thiết bị, dụng cụ 34 2. Phương pháp nghiên cứu 35 2. Thiết kế thí nghiệm 37 2. Chiết xuất, phân lập, tinh chế 37 2.

Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất 40 2. Đánh giá độ tinh khiết và phân tích tạp chất 40 2. Thiết lập chất chuẩn và xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất chuẩn 41 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 49 3.

Chiết xuất, phân lập và tinh chế các hợp chất tự nhiên từ dược liệu 49 3. Chiết xuất, phân lập và tinh chế Conessin từ Mức hoa trắng 49 3. Chiết xuất, phân lập và tinh chế Kaempferol từ Đơn lá đỏ 56 3. Chiết xuất, phân lập và tinh chế Nuciferin từ lá Sen 65 3.

Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng và xác định độ tinh khiết của các chất 69 3. Đặc điểm cảm quan 69 3. Kết quả đo phổ 70 3. Xác định độ tinh khiết bằng quét nhiệt vi sai 76 3.

Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn đối chiếu 78 3. Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích 78 3. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng đánh giá chất chuẩn 87 3. Áp dụng tiêu chuẩn chất lượng và phương pháp phân tích đã được thẩm định để xác định chất lượng nguyên liệu thiết lập chuẩn 88 3.

Đóng gói và đánh giá đồng nhất lô 96 3. Đánh giá liên phòng thí nghiệm và xác định giá trị ấn định 97 3. Kết quả nghiên cứu độ ổn định của chất chuẩn đối chiếu 100 3. Đề cương nghiên cứu độ ổn định 100 3.

Kết quả đánh giá độ ổn định của các chất chuẩn đối chiếu sau 9 tháng 102 3. Kết quả đánh giá độ ổn định của các chất chuẩn đối chiếu sau 15 tháng 106 3. Kết quả ứng dụng chất chuẩn đối chiếu 107 3. Định lượng Kaempferol trong dược liệu 108 3.

Định lượng Conessin trong chế phẩm đông dược 115 CHƯƠNG 4. Về việc lựa chọn đối tượng nghiên cứu 124 4. Về các phương pháp nghiên cứu đã sử dụng 124 4. Nhóm các phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế 124 4.

Nhóm các phương pháp nhận dạng, xác định độ tinh khiết 126 4. Phương pháp định lượng và xác định tạp chất liên quan 127 4. Về qui trình chiết xuất, phân lập và tinh chế 128 4. Chiết xuất, phân lập, tinh chế Conessin 128 4.

Chiết xuất, phân lập, tinh chế Kaempferol 130 4. Chiết xuất, phân lập, tinh chế Nuciferin 131 4. Về bộ dữ liệu nhận dạng và độ tinh khiết của các hợp chất 133 4. Về bộ dữ liệu đo phổ 133 4.

Về độ tinh khiết xác định bằng kĩ thuật quét nhiệt vi sai 133 4. Về kết quả nghiên cứu thiết lập chất chuẩn đối chiếu 133 4. Về tiêu chuẩn chất lượng của chất chuẩn đối chiếu 133 4. Về qui trình đánh giá chất lượng của chất chuẩn đối chiếu 135 4.

Về qui trình đóng gói và đánh giá độ đồng nhất lô 136 4. Về độ ổn định của chất chuẩn đối chiếu 136 4. Về độ ổn định ở thời điểm 9 tháng 137 4. Về độ ổn định ở thời điểm 15 tháng 138 4.

Về việc ứng dụng các chất chuẩn đối chiếu 139 4. Định lượng Kaempferol trong dược liệu 139 4. Định lượng Conessin trong chế phẩm đông dược 140 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 141 Kết luận 141 Đề xuất 142 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril ACRS Chất chuẩn đối chiếu hóa học của ASEAN (Asean Chemical Reference Substance) ASEAN Hiệp Hội Các Nước Đông Nam Á (Association of Southeast Asian Nations) CCĐC Chất chuẩn đối chiếu CE Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis) CTCL Chỉ tiêu chất lượng DSC Đo nhiệt vi sai (Differential Scanning Calorimetry) EDQM Ủy ban Châu Âu về chất lượng thuốc và chăm sóc y tế (European Directorate for the Quality of Medicine & HealthCare) EP Dược điển Châu Âu (European Pharmacopoeia) EPCRS Chất chuẩn đối chiếu Dược điển Châu Âu (European Pharmacopoeial Chemical Reference Substance) ESI-MS Khối phổ - ion hóa phun mù electron (Electron Spray Ionisation – Mass Spectrometry) EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol GC Sắc kí khí (Gas Chromatography) GLP Thực hành phòng thí nghiệm tốt (Good Laboratory Practice) HCTP Hợp chất toàn phần HĐDĐ Hội đồng Dược điển HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) HPLC-MS Sắc kí lỏng - khối phổ (High Performance Liquid Chromatography– Mass Spectrometry) HPTLC Sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao (High Performance Thin Layer Chromatography) ICRS Chất chuẩn đối chiếu Dược điển Quốc tế (International Pharmacopoeial Chemical Reference Substance) IP Dược điển Quốc tế (International Pharmacopoeia) IR Hồng ngoại (Infrared) ISO Tổ chức Quốc tế về Tiêu chuẩn hóa (International Organization for Standardization) JPMA Hiệp hội các nhà sản xuất dược Nhật Bản (Japan Pharmaceutical Manufacturers Association) LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation) MeOH Methanol NLĐC Nguyên liệu đối chiếu NMR Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) NSX Nhà sản xuất PCRS Chất chuẩn đối chiếu hóa học sơ cấp (Primary Chemical Reference Substance) PPPT Phương pháp phân tích PTN Phòng thí nghiệm RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) SCRS Chất chuẩn đối chiếu hóa học thứ cấp (Secondary Chemical Reference Substance) SKĐ Sắc kí đồ TCCL Tiêu chuẩn chất lượng TLC Sắc kí lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) UNDP Chương Trình Phát Triển Liên Hợp Quốc (United Nations Development Programme) USPRS Chất chuẩn đối chiếu Dược điển Mĩ (United State Pharmacopoeial Reference Standard) UV Tử ngoại (Ultraviolet) UV-VIS Tử ngoại – khả kiến (Ultraviolet – Visible) VKNTTƯ Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương kl/tt Khối lượng/thể tích tt/tt Thể tích/thể tích tt/tt/tt Thể tích/thể tích/thể tích DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3. Hiệu suất chiết alcaloid toàn phần từ vỏ thân Mức hoa trắng.

Kết quả khảo sát hàm lượng cắn flavonoid toàn phần từ đơn lá đỏ 57 Bảng 3. Hàm lượng Kaempferol trung bình trong cắn EtOAc 59 Bảng 3. Hàm lượng Kaempferol có thể chiết xuất được từ Đơn lá đỏ 60 Bảng 3. Thành phần và thể tích các hệ dung môi giải hấp phụ cột silicagel 62 Bảng 3.

Giá trị Rf và màu sắc các vết sắc kí của Kaempferol tinh chế được với các hệ dung môi I, II, III 65 Bảng 3. Hàm lượng alcaloid toàn phần trong lá Sen thu được bằng hai phương pháp chiết 66 Bảng 3. Đặc điểm cảm quan của các chất 69 Bảng 3. Kết quả đo điểm chảy 70 Bảng 3.

Kết quả đo phổ tử ngoại khả kiến 71 Bảng 3. Kết quả đo phổ hồng ngoại 71 Bảng 3. Kết quả đo phổ khối lượng (ESI-MS) 72 Bảng 3. Kết quả phân tích phổ NMR của Conessin 73 Bảng 3.

Kết quả phân tích phổ NMR của Kaempferol 74 Bảng 3. Kết quả phân tích phổ NMR của Nuciferin 75 Bảng 3. Kết quả xác định độ tinh khiết bằng quét nhiệt vi sai 76 Bảng 3. Loại cột HPLC đã khảo sát xây dựng phương pháp phân tích 78 Bảng 3.

Khảo sát pha động và thành phần pha động 78 Bảng 3. Kết quả khảo sát bước sóng phát hiện 80 Bảng 3. Một số thông số thể hiện sự phù hợp của hệ HPLC đã lựa chọn 80 Bảng 3. Kết quả khảo sát độ chính xác của 3 chất 83 Bảng 3.

Kết quả khảo sát tính tuyến tính với Conessin 84 Bảng 3.