Luận án tiến sĩ nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng dược lý của sâm việt n

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LÊ THỊ HỒNG VÂN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦA SÂM VIỆT NAM CHẾ BIẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LÊ THỊ HỒNG VÂN KHƯU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦA SÂM VIỆT NAM CHẾ BIẾN Chuyên ngành: Dược liệu - Dược học cổ truyền Mã số: 9720206 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS. Nguyễn Minh Đức PGS. Nguyễn Ngọc Khôi 1. NGUYỄN MINH ĐỨC 2.

NGUYỄN NGỌC KHÔI Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu này là của riêng tôi. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận án này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Lê Thị Hồng Vân MỤC LỤC. Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT, BẢNG ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ ANH VIỆT.

i DANH MỤC CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP. iv DANH MỤC HÌNH. v DANH MỤC BIỂU ĐỒ. vii DANH MỤC BẢNG .viii MỞ ĐẦU.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU. THỰC VẬT HỌC CÁC LOÀI THUỘC CHI PANAX. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÁC LOÀI THUỘC CHI PANAX. THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC TỪ CÁC DẠNG CHẾ BIẾN KHÁC NHAU CỦA CÁC LOÀI THUỘC CHI PANAX.

PHÂN TÍCH SAPONIN TRONG CÁC LOÀI THUỘC CHI PANAX. SÂM VIỆT NAM. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. NGUYÊN VẬT LIỆU.

NƠI THỰC HIỆN ĐỀ TÀI. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. KIỂM NGHIỆM NGUYÊN LIỆU. PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN SAPONIN TRONG CÁC BỘ PHẬN CỦA SÂM VN.

THÀNH PHẦN SAPONIN CỦA SÂM VN CHẾ BIẾN. NGHIÊN CỨU SỰ THAY ĐỔI THÀNH PHẦN HÓA HỌC SAPONIN TRONG QUÁ TRÌNH CHẾ BIẾN SÂM VN. SỰ THAY ĐỔI TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA SÂM VN QUA QUÁ TRÌNH CHẾ BIẾN. PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN SAPONIN TRONG SÂM VN.

THÀNH PHẦN SAPONIN CỦA SÂM VN CHẾ BIẾN. SỰ THAY ĐỔI TÁC DỤNG SINH HỌC DO QUÁ TRÌNH CHẾ BIẾN SÂM VN. 139 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN. 140 TÀI LIỆU THAM KHẢO i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT, BẢNG ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ ANH VIỆT Chữ viết tắt Chữ nguyên Nghĩa tiếng Việt ACN Acetonitrile Acetonitril ADP Adenosine Diphosphate Adenosin Diphosphat AF Arginine-Fructose Arginin-Fructose AFG Arginine-Fructose-Glucose Arginin-Fructose-Glucose ALT Alanine Aminotransferase APCI Atmospheric Pressure Chemical Ion hóa hóa học ở áp suất khí Ionization quyển Ara α-L-arabinopyranosyl α-L-arabinopyranosyl AST Aspartate Aminotransferase Bcl-2 B-cell lymphoma 2 COSY Correlation Spectroscopy Phổ tương quan COX Cyclooxygenase Cyclooxygenase CTPT Công thức phân tử DBMA 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene DCF-DA 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate DHPPD Dihydro Protopanaxadiol Dihydro Protopanaxadiol DHPPT Dihydro Protopanaxatriol Dihydro Protopanaxatriol DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl EA Ethyl acetate ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym ELSD Evaporative light scattering detector Đầu dò tán xạ ánh sáng bay hơi EP European Pharmacopeia Dược điển Châu Âu ESI Electrospray Ionization Ion hóa phun điện tử FBS Fetal bovine serum G- Ginsenoside Ginsenosid Glc β-D-glucospyranosyl β-D-glucospyranosyl HMBC Heteronuclear Multiple Bond Kết nối dị hạt nhân nhiều nối Coherence ii Chữ viết tắt Chữ nguyên Nghĩa tiếng Việt HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography HPMAE High Pressure Microwave Chiết xuất hỗ trợ vi sóng áp Assisted Extraction suất cao HR-ESI-MS High Resolution ElectroSpray Phổ khối phân giải cao ion hóa Ionisation Mass Spectrometry HSQC Heteronuclear Single Quantum Phổ tương quan dị hạt nhân Correlation IBα Nuclear Factor of Kappa Light Polypeptide Gene Enhancer in B-Cells Inhibitor alpha IC50 Inhibition Concentration 50% Nồng độ ức chế 50% IL Interleukin iNOS Inducible NO Synthase Enzyme cảm ứng tổng hợp nitric oxit IRAK1 IL-1 Receptor Associated Kinase 1 Kinase 1 kết hợp với thụ thể IL-1 IT-TOF-MS Iontrap-Time of Flight-Mass Khối phổ bẫy ion thời gian bay Spectroscopy J Coupling constant Hằng số ghép KLTP Khối lượng phân tử KP Korean Pharmacopeia Dược điển Hàn Quốc LC/MS Liquid Chromatography-Mass Sắc ký lỏng ghép khối phổ Spectroscopy LPS Lipopolysaccharides Lipopolysaccharid MAE Microwave assisted extraction Chiết xuất hỗ trợ sóng siêu âm MDA Malondialdehyde Malondialdehyd MeOH Methanol MG Malonyl ginsenoside Malonyl ginsenosid miRNA Micro RNA M-R2 Majonoside-R2 Majonosid-R2 NF-B Nuclear Factor Kappa Beta Yếu tố nhân kappa B NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân N-R1 Notoginsenoside R1 Notoginsenosid R1 iii Chữ viết tắt Chữ nguyên Nghĩa tiếng Việt OA Oleanolic acid Acid oleanolic OCT Ocotillol Ocotillol p53 Protein p53 PDA Photodiod array Đầu dò dãy diod quang PG Prostaglandin PLE Pressurized liquid extraction Chiết lỏng áp suất cao PPD Protopanaxadiol Protopanaxadiol ppm Parts per million Phần triệu PPT Protopanaxatriol Protopanaxatriol Prep-HPLC Preparative High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao điều Chromatography chế P-RT4 Pseudoginsenoside RT4 Pseudoginsenosid RT4 Q-TOF-MS Quadrupole-Time of flight-Mass Khối phổ Tứ cực - Thời gian Spectroscopy bay RID Refractive Index Detector Đầu dò chỉ số khúc xạ ROESY Rotating Frame Nuclear Overhauser Hiệu ứng hạt nhân Overhauser Effect Spectroscopy ROS Reactive Oxygen Species Gốc tự do oxy hóa RP-18 Reversed Phase C-18 Pha đảo C-18 Rt Retention Time Thời gian lưu Sâm VN Sâm Việt Nam SKC Sắc ký cột SKĐ Sắc ký đồ SKLM Sắc ký lớp mỏng TAK1 Tumor Growth Factor-β-Activated Enzyme Kinase 1 hoạt hóa yếu Kinase 1 tố sinh trưởng β của khối u TNF Tumor Necrosis Factor Yếu tổ hoại tử khối u TPA 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate USP United State Pharmacopeia Dược điển Mỹ UV Ultraviolet Tử ngoại Xyl β-D-xylopyranosyl β-D-xylospyranosyl iv DANH MỤC CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP STT Tên gọi Ký hiệu Hợp chất được đánh số 1.

Ginsenosid Ra1 G-Ra1 20 9. Ginsenosid Rb1 G-Rb1 19 10. Ginsenosid Rb2 G-Rb2 18 11. Ginsenosid Rd G-Rd 17 12.

Ginsenosid Re G-Re 16 13. Ginsenosid Rg1 G-Rg1 14 14. Ginsenosid Rg3 G-Rg3 1 15. Ginsenosid Rg5 G-Rg5 10 16.

Ginsenosid Rh1 G-Rh1 3 17. Ginsenosid Rh4 G-Rh4 6 18. Ginsenosid Rk1 G-Rk1 9 19. Ginsenosid Rk3 G-Rk3 5 20.

Pseudo-ginsenosid RT4 P-RT4 7 28. Vina-ginsenosid R2 V-R2 2 v DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1. Cấu trúc của gen trnK. Cây phát sinh loài dựa trên kết hợp dữ liệu gen trnK và trình tự gen 18S rRNA.

Khung cơ bản của các saponin và phần đường phổ biến của các saponin thuộc chi Panax. Sự hình thành các ginsenosid trong quá trình chế biến (hấp). Nhận diện và truyền tín hiệu lipopolysacharid (LPS) trong đại thực bào. Phần trên mặt đất (a) và phần dưới mặt đất (b) của Sâm VN.

Các hợp chất polyacetylen phân lập từ phần dưới mặt đất của Sâm VN. Cấu trúc của saponin phân lập từ Sâm VN. Bộ phận dưới mặt đất của Sâm VN. SKĐ SKLM của các bộ phận khác nhau của Sâm VN.

SKĐ ELSD (a) và LC/MS (b) của rễ con Sâm VN. SKĐ HPLC/ELSD đại diện cho 5 bộ phận khác nhau của Sâm VN. Hình ảnh đại diện Sâm VN tươi (A), sấy khô (B) và sau chế biến (C). SKĐ đại diện HPLC/ELSD phân tích các mẫu Sâm VN chưa chế biến (A) và Sâm VN chế biến ở 8 giờ (B).

Sơ đồ quy trình chiết các cao từ dược liệu Sâm VN chế biến. Sơ đồ phân lập các thành phần từ cao EA. SKĐ HPLC/ELSD phân tích mẫu rễ con (a) và phân đoạn Bu1. Sơ đồ phân lập các thành phần từ cao Bu1.

Quy trình phân lập các hợp chất từ cao chiết Bu2. Cấu trúc phần đường gắn vào vị trí C-20 của hợp chất 22 (a) và notoginsenosid Q (b). Cấu trúc của hợp chất 22. Cấu trúc notoginsenosid D (hợp chất 23).

SKĐ HPLC/ELSD đại diện Sâm VN chế biến ở 105 ℃. SKĐ HPLC/ELSD đại diện Sâm VN chế biến ở 120 ℃. Độc tính trên tế bào đại thực bào phúc mạc. Tác dụng của M-R2, P-RT4 và OCT trên biểu hiện của các yếu tố tham gia đường truyền tín hiệu viêm thông qua NF-κB khi xử lý với LPS.

Tác dụng của M-R2, P-RT4 và OCT lên sự chuyển vị NF-κB vào nhân tế bào. Tác động của P-RT4 và OCT trên hoạt hóa NF-κB trong đại thực bào gây bởi LPS. Tác dụng của P-RT4 và OCT trên gắn kết LPS lên TLR4 ở đại thực bào chuyển nhiễm với MyD88 siRNA. 120 vii DANH MỤC BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ 3.

Biểu đồ so sánh hàm lượng các saponin chính nhóm PPT, PPD và OCT trong các bộ phận dưới mặt đất của Sâm VN. Sự thay đổi hàm lượng saponin có aglycon thuộc khung PPD, PPT và OCT trong quá trình chế biến Sâm VN ở 105 ℃. Sự thay đổi hàm lượng saponin phân cực khi chế biến Sâm VN ở 120 ℃. Sự thay đổi hàm lượng saponin kém phân cực khi chế biến Sâm VN ở 120 ℃.

Hoạt tính chống gốc tự do DPPH của Sâm VN ở thời điểm chế biến khác nhau tại 120 ℃. Tác dụng kháng phân bào của Sâm VN chế biến ở điều kiện 105 ℃ trong khoảng thời gian từ 2-20 giờ trên dòng tế bào ung thư phổi A549. Sự thay đổi tác dụng kháng phân bào của Sâm VN chế biến ở 120 ℃ trên dòng tế bào ung thư phổi A549. Tác dụng kháng phân bào của Sâm VN chế biến ở 105 ℃ trong 8 giờ so với Sâm VN chưa chế biến trên dòng tế bào ung thư phổi A549.

Tác dụng kháng phân bào trên dòng tế bào ung thư phổi A549 của các saponin phân lập từ Sâm VN chế biến. 117 viii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1. Các loài thuộc chi Panax trên thế giới. Phân bố một số loài Panax trên thế giới.

Phân bố một số saponin chính trong một số loài thuộc chi Panax. Các ginsenosid được hình thành do quá trình chế biến P. Tóm tắt chỉ tiêu phân tích trong các chuyên luận Dược điển của các loài Panax phổ biến. Các saponin được phân lập từ Sâm VN.

Các tác dụng dược lý của Sâm VN đã nghiên cứu và công bố. Nồng độ giai mẫu xây dựng đường tuyến tính HPLC-ELSD (mg/ml). Nồng độ giai mẫu xây dựng đường tuyến tính HPLC-UV (mg/ml). Kết quả LC/MS và Q-TOF-MS định danh các pic chính trên SKĐ HPLC của mẫu rễ con Sâm VN.

Kết quả độ đúng của 9 saponin chính trong Sâm VN. Đường tuyến tính của 9 saponin chính với đầu dò ELSD và UV. Độ lặp lại trong ngày và liên ngày của phương pháp HPLC-ELSD-UV. Khối lượng Sâm VN ở các bộ phận khác nhau.

Hàm lượng1) saponin trong các bộ phận thân rễ, rễ củ và rễ con. Khối lượng các lô Sâm VN trước và sau chế biến. Kết quả chiết xuất các cao chiết của Sâm VN chế biến. Kết quả phân lập bằng SKC cao EA.

Kết quả phân lập từ cao Bu1. Kết quả phân lập từ các phân đoạn của cao Bu2. Dữ liệu về cảm quan, đặc điểm hóa học và MS của các hợp chất phân lập được. Dữ liệu phổ 13C-NMR (C, 125 MHz) của hợp chất 8, 14, 15, 16 và N-R2 .