Luận án TS Dược học: Tiêu chuẩn hóa cao alkaloid flavonoid từ khổ sâm bắc (Đắk Nông)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHBỘ Y TẾ PHAN NGUYỄN TRƯỜNG THẮNG TIÊU CHUẨN HÓA DƯỢC LIỆU, CAO ALKALOID VÀ CAO FLAVONOID TỪ KHỔ SÂM BẮC (Sophora flavescens Ait.) TRỒNG TẠI ĐẮK NÔNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ Y TẾ PHAN NGUYỄN TRƯỜNG THẮNG TIÊU CHUẨN HÓA DƯỢC LIỆU, CAO ALKALOID VÀ CAO FLAVONOID TỪ KHỔ SÂM BẮC (Sophora flavescens Ait.) TRỒNG TẠI ĐẮK NÔNG NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 62.10 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. NGUYỄN NGỌC VINH 2. TRẦN ANH VŨ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố ở bất kỳ nơi nào. Tác giả luận án i MỤC LỤC Trang Tổng quan về thực vật học của Khổ sâm bắc .3 Tổng quan về thành phần hóa học của Khổ sâm bắc .6 Chiết xuất và phân lập các thành phần flavonoid và alkaloid từ Khổ sâm bắc .13 Các phương pháp phân tích flavonoid và alkaloid Khổ sâm bắc .27 Tác dụng dược lý và công dụng của Khổ sâm bắc .33 Chuẩn hóa dược liệu và yêu cầu chất lượng Khổ sâm bắc theo các Dược điển hiện hành.39 Giới thiệu về cao dược liệu .43 Thiết kế nghiên cứu .48 Đối tượng nghiên cứu .49 Thời gian và địa điểm nghiên cứu .49 Cỡ mẫu của nghiên cứu .49 Xác định các biến số độc lập và phụ thuộc .50 Phương pháp và công cụ đo lường, thu thập số liệu .50 Quy trình nghiên cứu .53 Phương pháp phân tích dữ liệu .75 ii Xây dựng quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế các alkaloid, flavonoid từ rễ Khổ sâm bắc .76 Thiết lập chất đối chiếu .104 Xây dựng quy trình định tính, định lượng alkaloid, flavonoid trong rễ Khổ sâm bắc, các cao chiết từ rễ Khổ sâm bắc.114 Đánh giá tác dụng sinh học của cao toàn phần, cao alkaloid, cao flavonoid và các chất phân lập .133 Tiêu chuẩn hóa cao chiết và dược liệu Khổ sâm bắc .138 Xây dựng quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế từ Khổ sâm bắc .142 Đánh giá chất đối chiếu .149 Xây dựng quy trình định tính, định lượng alkaloid, flavonoid trong rễ Khổ sâm bắc, các cao chiết từ rễ Khổ sâm bắc.150 Đánh giá tác dụng sinh các cao chiết và hoạt chất từ Khổ sâm bắc.157 Tiêu chuẩn hóa cao chiết và dược liệu Khổ sâm bắc .161 iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH – VIỆT Ký hiệu, chữ Từ nguyên Nghĩa tiếng Việt viết tắt AChE Acetylcholinesterase Acetylcholinesterase CL Chloroform Cloroform 13 C-NMR Carbon nuclear magnetic resonance Phổ carbon DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DMEM Dulbecco's modified Eagle's DMEM DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl EA Ethyl acetate Ethyl acetat EC50 Half maximal effective concentration Nồng độ hiệu quả tối đa một nửa EMA European Medicines Agency Cơ quan Quản lý thuốc Châu Âu ESI Electrospray Ionization Ion hóa phun điện FeCl3 Ferric Chloride Sắt (III) clorid H2SO4 Sulfuric acid Acid sulfuric HKCMMS The Hong Kong Chinese Materia Tiêu chuẩn dược liệu Hồng Kông Medica Standards Trung Quốc 1 H-NMR Proton nuclear magnetic resonance Phổ proton HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography HSQC Hetetonuclear Single Quantum Coherence HTCO Hoạt tính chống oxi hóa Hoạt tính chống oxi hóa iv Ký hiệu, chữ Từ nguyên Nghĩa tiếng Việt viết tắt IC50 The half-maximal inhibitory Nồng độ tối đa ức chế một nửa concentration IUPAC International Union of Pure and Hiệp hội Quốc tế về Hóa học thuần Applied Chemistry túy và ứng dụng LC Liquid Chromatography Sắc ký lỏng MDA Malondialdehyd Malondialdehyd MS Mass Spectrometry Khối phổ MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyl tetrazolium bromid) diphenyl tetrazolium bromid) N Number of therical plates Số đĩa lý thuyết NA Not analysis Không phân tích NH3 Amoniac Amoniac RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối Rt Retention time Thời gian lưu tương đối SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn SDH Succinat dehydrogenase succinat dehydrogenase SKLM Sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng SPE Solid Phase Extraction Chiết pha rắn Tf, As Tailing factor, Asymmetry Hệ số kéo đuôi, hệ số bất đối xứng UV Ultraviolet Ánh sáng tử ngoại v DANH MỤC CÁC BẢNG Trang vi vii viii ix DANH MỤC CÁC HÌNH Trang x xi 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam là đất nước với nguồn tài nguyên phong phú và đa dạng sinh học, nhiều loài thực vật được phát hiện có tác dụng hỗ trợ và điều trị bệnh, là điều kiện rất thuận lợi trong việc nghiên cứu và phát triển các thuốc có nguồn gốc thảo dược, phù hợp với định hướng phát triển ngành dược Việt Nam.

Trong kho tàng cây thuốc Việt Nam, ngoài những cây có nguồn gốc bản địa thì nhiều cây thuốc di thực như Đương Quy, Đan Sâm, … thực sự là những nguồn cung cấp quan trọng, hạn chế nhập khẩu và giảm bớt sự phụ thuộc của ngành dược liệu Việt Nam vào nguồn cung bên ngoài. Một trong những dược liệu quý được di thực đó là Khổ sâm bắc hay còn gọi là Khổ sâm cho rễ (Sophora flavescens Ait.) và thường hay có sự nhầm lẫn với Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep.) vì hay gọi chung là Khổ sâm. Khổ sâm bắc (Sophora flavescens Ait.) được sử dụng nhiều ở Trung Quốc, Nhật Bản và đã được di thực từ những năm 90 của thế kỷ XX, chúng thích nghi với khí hậu và phát triển tốt, đặc biệt ở các vùng núi như Đắk Nông, Sapa. Một số chế phẩm chứa dược liệu này được sản xuất tại Việt Nam như Ninh tâm vương được dùng hỗ trợ trong bệnh lý nhịp tim nhanh, Nữ vương hỗ trợ trong điều trị viêm nhiễm phụ khoa ở nữ giới.

Khổ sâm bắc là dược liệu được sử dụng từ lâu trong y học cổ truyền phương đông, để chữa nhiều bệnh như chống loạn nhịp, các chứng viêm, xuất huyết tiêu hoá, lỵ và ký sinh trùng1-4. Hiện nay, trên thị trường thuốc trên thế giới có nhiều sản phẩm thuốc và thực phẩm chức năng từ Sophora flavescens như “dung dịch tiêm Yanshu, Fufang kushen” của công ty Dược phẩm Zhendong (Trung Quốc), “thực phẩm bổ sung Kushen và Kushen hawaii pharm” của công ty Nature’s Health (Mỹ). Chuyên luận về Sophora flavescens đã được đề cập trong các ấn bản của dược điển Trung Quốc (2020), dược điển Nhật Bản (JP17) và dược điển Hồng Kông 2017 với chỉ tiêu định tính và định lượng dược liệu dựa vào 3 alkaloid chính là matrin, oxymantrin và sophoridin5, 6. Bên cạnh thành phần alkaloid, flavonoid cũng là một trong những nhóm hợp chất chính trong Khổ sâm bắc4, 7, 8.

Trong hơn năm thập kỷ qua, hàng trăm hợp chất flavonoid đã được phân lập với nhiều tác dụng dược lý đã 2 được chứng minh in vitro và in vivo như diệt khối u, kháng khuẩn 9 kháng viêm 10 và kháng virus11. Tuy nhiên, flavonoid vẫn chưa có trong chỉ tiêu đánh giá chất lượng của dược liệu Khổ sâm bắc, với hàm lượng cao và tính chất dược lý của flavonoid, các nhà khoa học đề nghị đưa nhóm hoạt chất flavonoid trở thành một trong những chỉ tiêu đánh giá chất lượng của dược liệu này2. Tuy nhiên, một số hợp chất như kurarinon và sophoraflavanon G nằm trong nhóm hợp chất này có độc tính khi dùng liều cao. Vì vậy, việc tiêu chuẩn hóa các cao chiết alkaloid, cao chiết flavonoid sẽ giúp chuyên biệt hóa tác dụng, giảm nguy cơ gây độc cho người dùng.

Tuy vậy, Dược điển Việt Nam V hiện nay vẫn chưa có chuyên luận riêng về dược liệu Khổ sâm bắc, đồng thời hiện nay chỉ có một số công trình nghiên cứu về dược liệu Khổ sâm bắc tại Việt Nam12 gây khó khăn trong việc đánh giá chất lượng dược liệu thô và chế phẩm chứa dược liệu này trong nước và ngoại nhập. Nhằm đáp ứng nhu cầu kiểm soát chất lượng và phục vụ công tác kiểm nghiệm thuốc và dược liệu trong nước, luận án “Tiêu chuẩn hóa dược liệu, cao alkaloid và cao flavonoid từ Khổ sâm bắc (Sophora flavescens Ait.) trồng tại Đắk Nông” được thực hiện với các mục tiêu nghiên cứu sau: - Xây dựng quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế các alkaloid, flavonoid từ Khổ sâm bắc. - Thiết lập chất đối chiếu các chất phân lập từ Khổ sâm bắc - Xây dựng quy trình định tính, định lượng alkaloid, flavonoid trong Khổ sâm bắc, các cao chiết từ Khổ sâm bắc. - Nghiên cứu thử tác dụng sinh học của các cao chiết và các chất phân lập được từ Khổ sâm bắc.

- Tiêu chuẩn hóa cao chiết và dược liệu Khổ sâm bắc. 3 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan về thực vật học của Khổ sâm bắc Đặc điểm thực vật học của loài Khổ sâm bắc Vị trí phân loại - Tên khoa học: Sophora flavescens Aiton - Tên thông thường: Khổ sâm bắc - Tên gọi khác: Dã hòe, Khổ cốt, Khổ sâm cho rễ, Sơn đậu căn, Ðịa sâm… - Theo hệ thống phân loại của Takhtajan A.L công bố năm 1987 và sửa đổi năm 200913, cây Khổ sâm bắc có vị trí phân loại thực vật như sau: Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa hồng (Rosidae) Liên bộ Đậu (Fabaceae) Bộ Đậu (Fabales) Họ Đậu (Fabaceae) Chi Sophora Loài Sophora flavescens Ait. Đặc điểm hình thái Khổ sâm bắc là cây bụi nhỏ, cao khoảng 0,5 - 1,2 m hoặc hơn. Rễ hình trụ dài, vỏ ngoài màu vàng trắng.

Thân thường phân nhiều cành, cành non có lông tơ rải rác. Lá kép lông chim lẻ mọc so le, gồm 5 - 10 đôi lá chét hình mác dài khoảng 3 - 4 cm, rộng 1 - 2 cm, dốc thuôn, đầu nhọn hoặc hơi tù, mặt trên nhẵn, mặt dưới phủ lông mịn màu xám. Cụm hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành thành chùm dài 10 - 20 cm. Hoa màu vàng nhạt, đài 5 răng hình chuông, tràng 5 cánh không đều, nhị 10, rời nhau, bầu có lông mịn.

Quả đậu, thắt lại giữa các hạt, thuôn dài 5 - 12 cm, đường kính 5 - 8 mm, đầu có mỏ thuôn dài; hạt 3 - 7, hình cầu, màu đen 1, 14 4 (A) Các phần trên mặt đất (B) Rễ cây (C) Dược liệu được cắt lát Cây Khổ sâm bắc Sophora flavescens Ait. Nguồn Xirui He, 20152. Đặc điểm vi học Tzu Che Lin đã mô tả một số đặc điểm vi học rễ, thân, lá của S. flavescens 15 Vi phẫu rễ: Rễ cắt ngang có tiết diện gần tròn.

Bần gồm 9 – 12 lớp tế bào hình chữ nhật dẹp, xếp xuyên tâm, thường bị bong tróc. Vùng vỏ gồm 22 – 28 lớp tế bào mô mềm. Thượng tầng gồm 2 – 6 lớp tế bào mô phân sinh kích thước nhỏ. Vùng trung trụ có 12 – 17 tia tủy.

Vi phẫu thân: Thân cắt ngang có tiết diện gần tròn.