Luận án Tiến sĩ: Tiêu chuẩn hóa Khổ sâm bắc, cao alkaloid, flavonoid (ĐHYD TPHCM)

Bà GIÁO DĀC VÀ ĐÀO T¾O Bà Y TÀ Đ¾I HâC Y D¯ĀC THÀNH PHà Hâ CHÍ MINHBà Y TÀ PHAN NGUYÄN TR¯äNG THÌNG TIÊU CHUÆN HÓA D¯ĀC LIÆU, CAO ALKALOID VÀ CAO FLAVONOID TĂ KHä SÂM BÌC (Sophora flavescens Ait.) TRâNG T¾I ĐÌK NÔNG LUÊN ÁN TI¾N S) D¯ĀC HâC THÀNH PHà Hâ CHÍ MINH, NM 2023 Bà GIÁO DĀC VÀ ĐÀO T¾O Bà Y TÀ Đ¾I HâC Y D¯ĀC THÀNH PHà Hâ CHÍ MINH Bà Y TÀ PHAN NGUYÄN TR¯äNG THÌNG TIÊU CHUÆN HÓA D¯ĀC LIÆU, CAO ALKALOID VÀ CAO FLAVONOID TĂ KHä SÂM BÌC (Sophora flavescens Ait.) TRâNG T¾I ĐÌK NÔNG NGÀNH: KIÂM NGHIÆM THUàC VÀ ĐàC CHÂT Mà Sà: 62.10 LUÊN ÁN TI¾N S) D¯ĀC HâC NG¯äI H¯âNG DÈN KHOA HâC: 1. NGUYÄN NGâC VINH 2. TRÄN ANH Vi THÀNH PHà Hâ CHÍ MINH, NM 2023 LäI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu căa riêng tôi, các kÁt qu¿ nghiên cứu đưÿc trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng đưÿc công bố á bÁt kỳ nơi nào. Tác gi¿ luận án i MĂC LĂC Trang Tổng quan về thực vật học căa Khổ sâm bắc .3 Tổng quan về thành phần hóa học căa Khổ sâm bắc .6 ChiÁt xuÁt và phân lập các thành phần flavonoid và alkaloid từ Khổ sâm bắc .13 Các phương pháp phân tích flavonoid và alkaloid Khổ sâm bắc .27 Tác dāng dưÿc lý và công dāng căa Khổ sâm bắc .33 Chuẩn hóa dưÿc liệu và yêu cầu chÁt lưÿng Khổ sâm bắc theo các Dưÿc điển hiện hành.39 Giới thiệu về cao dưÿc liệu .43 ThiÁt kÁ nghiên cứu .48 Đối tưÿng nghiên cứu .49 Thßi gian và địa điểm nghiên cứu .49 Cỡ mẫu căa nghiên cứu .49 Xác định các biÁn số đác lập và phā thuác .50 Phương pháp và công cā đo lưßng, thu thập số liệu .50 Quy trình nghiên cứu .53 Phương pháp phân tích dữ liệu .75 ii Xây dựng quy trình chiÁt xuÁt, phân lập và tinh chÁ các alkaloid, flavonoid từ rễ Khổ sâm bắc .76 ThiÁt lập chÁt đối chiÁu .104 Xây dựng quy trình định tính, định lưÿng alkaloid, flavonoid trong rễ Khổ sâm bắc, các cao chiÁt từ rễ Khổ sâm bắc.114 Đánh giá tác dāng sinh học căa cao toàn phần, cao alkaloid, cao flavonoid và các chÁt phân lập .133 Tiêu chuẩn hóa cao chiÁt và dưÿc liệu Khổ sâm bắc .138 Xây dựng quy trình chiÁt xuÁt, phân lập và tinh chÁ từ Khổ sâm bắc .142 Đánh giá chÁt đối chiÁu .149 Xây dựng quy trình định tính, định lưÿng alkaloid, flavonoid trong rễ Khổ sâm bắc, các cao chiÁt từ rễ Khổ sâm bắc.150 Đánh giá tác dāng sinh các cao chiÁt và ho¿t chÁt từ Khổ sâm bắc.157 Tiêu chuẩn hóa cao chiÁt và dưÿc liệu Khổ sâm bắc .161 iii DANH MĂC CÁC KÝ HIÆU, CÁC CHĀ VI¾T TÌT VÀ THUÊT NGĀ ANH – VIÆT Ký hiÇu, chā Tă nguyên Ngh*a ti¿ng ViÇt vi¿t tÍt AChE Acetylcholinesterase Acetylcholinesterase CL Chloroform Cloroform 13 C-NMR Carbon nuclear magnetic resonance Phổ carbon DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DMEM Dulbecco's modified Eagle's DMEM DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl EA Ethyl acetate Ethyl acetat EC50 Half maximal effective concentration Nồng đá hiệu qu¿ tối đa mát nửa EMA European Medicines Agency Cơ quan Qu¿n lý thuốc Châu Âu ESI Electrospray Ionization Ion hóa phun điện FeCl3 Ferric Chloride Sắt (III) clorid H2SO4 Sulfuric acid Acid sulfuric HKCMMS The Hong Kong Chinese Materia Tiêu chuẩn dưÿc liệu Hồng Kông Medica Standards Trung Quốc 1 H-NMR Proton nuclear magnetic resonance Phổ proton HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography HSQC Hetetonuclear Single Quantum Coherence HTCO Ho¿t tính chống oxi hóa Ho¿t tính chống oxi hóa iv Ký hiÇu, chā Tă nguyên Ngh*a ti¿ng ViÇt vi¿t tÍt IC50 The half-maximal inhibitory Nồng đá tối đa ức chÁ mát nửa concentration IUPAC International Union of Pure and Hiệp hái Quốc tÁ về Hóa học thuần Applied Chemistry túy và ứng dāng LC Liquid Chromatography Sắc ký lỏng MDA Malondialdehyd Malondialdehyd MS Mass Spectrometry Khối phổ MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyl tetrazolium bromid) diphenyl tetrazolium bromid) N Number of therical plates Số đĩa lý thuyÁt NA Not analysis Không phân tích NH3 Amoniac Amoniac RSD Relative Standard Deviation Đá lệch chuẩn tương đối Rt Retention time Thßi gian lưu tương đối SD Standard Deviation Đá lệch chuẩn SDH Succinat dehydrogenase succinat dehydrogenase SKLM Sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng SPE Solid Phase Extraction ChiÁt pha rắn Tf, As Tailing factor, Asymmetry Hệ số kéo đuôi, hệ số bÁt đối xứng UV Ultraviolet Ánh sáng tử ngo¿i v DANH MĂC CÁC BÀNG Trang vi vii viii ix DANH MĂC CÁC HÌNH Trang x xi 1 Đ¾T VÂN ĐÀ Việt Nam là đÁt nước với nguồn tài nguyên phong phú và đa d¿ng sinh học, nhiều loài thực vật đưÿc phát hiện có tác dāng hß trÿ và điều trị bệnh, là điều kiện rÁt thuận lÿi trong việc nghiên cứu và phát triển các thuốc có nguồn gốc th¿o dưÿc, phù hÿp với định hướng phát triển ngành dưÿc Việt Nam.

Trong kho tàng cây thuốc Việt Nam, ngoài những cây có nguồn gốc b¿n địa thì nhiều cây thuốc di thực như Đương Quy, Đan Sâm, & thực sự là những nguồn cung cÁp quan trọng, h¿n chÁ nhập khẩu và gi¿m bớt sự phā thuác căa ngành dưÿc liệu Việt Nam vào nguồn cung bên ngoài. Mát trong những dưÿc liệu quý đưÿc di thực đó là Khổ sâm bắc hay còn gọi là Khổ sâm cho rễ (Sophora flavescens Ait.) và thưßng hay có sự nhầm lẫn với Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep.) vì hay gọi chung là Khổ sâm. Khổ sâm bắc (Sophora flavescens Ait.) đưÿc sử dāng nhiều á Trung Quốc, Nhật B¿n và đã đưÿc di thực từ những năm 90 căa thÁ kỷ XX, chúng thích nghi với khí hậu và phát triển tốt, đặc biệt á các vùng núi như Đắk Nông, Sapa. Mát số chÁ phẩm chứa dưÿc liệu này đưÿc s¿n xuÁt t¿i Việt Nam như Ninh tâm vương đưÿc dùng hß trÿ trong bệnh lý nhịp tim nhanh, Nữ vương hß trÿ trong điều trị viêm nhiễm phā khoa á nữ giới.

Khổ sâm bắc là dưÿc liệu đưÿc sử dāng từ lâu trong y học cổ truyền phương đông, để chữa nhiều bệnh như chống lo¿n nhịp, các chứng viêm, xuÁt huyÁt tiêu hoá, lỵ và ký sinh trùng1-4. Hiện nay, trên thị trưßng thuốc trên thÁ giới có nhiều s¿n phẩm thuốc và thực phẩm chức năng từ Sophora flavescens như <dung dịch tiêm Yanshu, Fufang kushen= căa công ty Dưÿc phẩm Zhendong (Trung Quốc), <thực phẩm bổ sung Kushen và Kushen hawaii pharm= căa công ty Nature’s Health (Mỹ). Chuyên luận về Sophora flavescens đã đưÿc đề cập trong các Án b¿n căa dưÿc điển Trung Quốc (2020), dưÿc điển Nhật B¿n (JP17) và dưÿc điển Hồng Kông 2017 với chỉ tiêu định tính và định lưÿng dưÿc liệu dựa vào 3 alkaloid chính là matrin, oxymantrin và sophoridin5, 6. Bên c¿nh thành phần alkaloid, flavonoid cũng là mát trong những nhóm hÿp chÁt chính trong Khổ sâm bắc4, 7, 8.

Trong hơn năm thập kỷ qua, hàng trăm hÿp chÁt flavonoid đã đưÿc phân lập với nhiều tác dāng dưÿc lý đã 2 đưÿc chứng minh in vitro và in vivo như diệt khối u, kháng khuẩn 9 kháng viêm 10 và kháng virus11. Tuy nhiên, flavonoid vẫn chưa có trong chỉ tiêu đánh giá chÁt lưÿng căa dưÿc liệu Khổ sâm bắc, với hàm lưÿng cao và tính chÁt dưÿc lý căa flavonoid, các nhà khoa học đề nghị đưa nhóm ho¿t chÁt flavonoid trá thành mát trong những chỉ tiêu đánh giá chÁt lưÿng căa dưÿc liệu này2. Tuy nhiên, mát số hÿp chÁt như kurarinon và sophoraflavanon G nằm trong nhóm hÿp chÁt này có đác tính khi dùng liều cao. Vì vậy, việc tiêu chuẩn hóa các cao chiÁt alkaloid, cao chiÁt flavonoid s¿ giúp chuyên biệt hóa tác dāng, gi¿m nguy cơ gây đác cho ngưßi dùng.

Tuy vậy, Dưÿc điển Việt Nam V hiện nay vẫn chưa có chuyên luận riêng về dưÿc liệu Khổ sâm bắc, đồng thßi hiện nay chỉ có mát số công trình nghiên cứu về dưÿc liệu Khổ sâm bắc t¿i Việt Nam12 gây khó khăn trong việc đánh giá chÁt lưÿng dưÿc liệu thô và chÁ phẩm chứa dưÿc liệu này trong nước và ngo¿i nhập. Nhằm đáp ứng nhu cầu kiểm soát chÁt lưÿng và phāc vā công tác kiểm nghiệm thuốc và dưÿc liệu trong nước, luận án <Tiêu chuÇn hóa d°āc liÇu, cao alkaloid và cao flavonoid tă Khå sâm bÍc (Sophora flavescens Ait.) trãng t¿i ĐÍk Nông” đưÿc thực hiện với các māc tiêu nghiên cứu sau: - Xây dựng quy trình chiÁt xuÁt, phân lập và tinh chÁ các alkaloid, flavonoid từ Khổ sâm bắc. - ThiÁt lập chÁt đối chiÁu các chÁt phân lập từ Khổ sâm bắc - Xây dựng quy trình định tính, định lưÿng alkaloid, flavonoid trong Khổ sâm bắc, các cao chiÁt từ Khổ sâm bắc. - Nghiên cứu thử tác dāng sinh học căa các cao chiÁt và các chÁt phân lập đưÿc từ Khổ sâm bắc.

- Tiêu chuẩn hóa cao chiÁt và dưÿc liệu Khổ sâm bắc. 3 TäNG QUAN TÀI LIÆU Tång quan vÁ thực vËt hãc cÿa Khå sâm bÍc Đặc điểm thực vật học cÿa loài Khổ sâm bắc Vị trí phân lo¿i - Tên khoa học: Sophora flavescens Aiton - Tên thông thưßng: Khổ sâm bắc - Tên gọi khác: Dã hòe, Khổ cốt, Khổ sâm cho rễ, Sơn đậu căn, Ðịa sâm& - Theo hệ thống phân lo¿i căa Takhtajan A.L công bố năm 1987 và sửa đổi năm 200913, cây Khổ sâm bắc có vị trí phân lo¿i thực vật như sau: Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa hồng (Rosidae) Liên bá Đậu (Fabaceae) Bá Đậu (Fabales) Họ Đậu (Fabaceae) Chi Sophora Loài Sophora flavescens Ait. Đặc điểm hình thái Khổ sâm bắc là cây bāi nhỏ, cao kho¿ng 0,5 - 1,2 m hoặc hơn. Rễ hình trā dài, vỏ ngoài màu vàng trắng.

Thân thưßng phân nhiều cành, cành non có lông tơ r¿i rác. Lá kép lông chim lẻ mọc so le, gồm 5 - 10 đôi lá chét hình mác dài kho¿ng 3 - 4 cm, ráng 1 - 2 cm, dốc thuôn, đầu nhọn hoặc hơi tù, mặt trên nhẵn, mặt dưới phă lông mịn màu xám. Cām hoa mọc á k¿ lá hoặc đầu cành thành chùm dài 10 - 20 cm. Hoa màu vàng nh¿t, đài 5 răng hình chuông, tràng 5 cánh không đều, nhị 10, rßi nhau, bầu có lông mịn.

Qu¿ đậu, thắt l¿i giữa các h¿t, thuôn dài 5 - 12 cm, đưßng kính 5 - 8 mm, đầu có mỏ thuôn dài; h¿t 3 - 7, hình cầu, màu đen 1, 14 4 (A) Các phần trên mặt đÁt (B) Rễ cây (C) Dưÿc liệu đưÿc cắt lát Cây Khổ sâm bắc Sophora flavescens Ait. Nguồn Xirui He, 20152. Đặc điểm vi học Tzu Che Lin đã mô t¿ mát số đặc điểm vi học rễ, thân, lá căa S. flavescens 15 Vi phẫu rễ: Rễ cắt ngang có tiÁt diện gần tròn.

Bần gồm 9 3 12 lớp tÁ bào hình chữ nhật dẹp, xÁp xuyên tâm, thưßng bị bong tróc. Vùng vỏ gồm 22 3 28 lớp tÁ bào mô mềm. Thưÿng tầng gồm 2 3 6 lớp tÁ bào mô phân sinh kích thước nhỏ. Vùng trung trā có 12 3 17 tia tăy.

Vi phẫu thân: Thân cắt ngang có tiÁt diện gần tròn.