Nghiên cứu tính đa hình gen AhR và AIP ở các nạn nhân phơi nhiễm dioxin – Luận án TS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------------------------- Lê Thị Kim Dung NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH GEN AhR VÀ AIP Ở CÁC NẠN NHÂN PHƠI NHIỄM DIOXIN LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2018 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------------------------- Lê Thị Kim Dung NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH GEN AhR VÀ AIP Ở CÁC NẠN NHÂN PHƠI NHIỄM DIOXIN Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62420121 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. Nguyễn Huy Hoàng Hà Nội – 2018 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT. 3 DANH MỤC CÁC BẢNG. 5 DANH MỤC CÁC HÌNH.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU. TỔNG QUAN VỀ DIOXIN. Khái niệm dioxin và các hợp chất tƣơng tự dioxin. Đặc tính của dioxin.

Ảnh hƣởng của dioxin đối với sức khỏe con ngƣời. CƠ CHẾ PHÂN TỬ TÁC ĐỘNG CỦA DIOXIN. Thụ thể AhR (Aryl hydrocarbon Receptor). Cơ chế tác động của dioxin thông qua thụ thể AhR.

Dioxin gây biến đổi vật chất di truyền. TỔNG QUAN VỀ GEN AhR. Đặc điểm gen AhR ở ngƣời. Vai trò của đa hình gen AhR trong đáp ứng dioxin và các chất ô nhiễm môi trƣờng.

TỔNG QUAN VỀ GEN AIP. Đặc điểm gen AIP. Đột biến gen AIP liên quan bệnh lý ở ngƣời. VAI TRÒ PROTEIN AIP TRONG CON ĐƢỜNG TÍN HIỆU THÔNG QUA THỤ THỂ AhR.

TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN CÁC NẠN NHÂN PHƠI NHIỄM DIOXIN Ở VIỆT NAM. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU .38 1 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.

PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Tách chiết DNA tổng số. Đo quang phổ DNA. Điện di DNA trên gel Agarose.

Khuếch đại gen bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction). Giải trình tự gen tự động. Giải trình tự toàn bộ hệ gen biểu hiện (WES). Xử lý số liệu và tính toán thống kê.

ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. MỘT SỐ CHỈ SỐ SINH HỌC CỦA ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU. ĐA HÌNH CÁC GEN AhR VÀ AIP.

Tách chiết DNA tổng số. Khuếch đại các đoạn gen AhR và AIP. Phân tích đa hình gen AhR. Phân tích đa hình gen AIP.

GIẢI TRÌNH TỰ TOÀN BỘ HỆ GEN BIỂU HIỆN (WES) NGƢỜI CÓ NỒNG ĐỘ DIOXIN TRONG MÁU CAO. Phân tích đa hình các gen AhR và AIP từ kết quả giải trình tự toàn bộ hệ gen biểu hiện, so sánh với kết quả giải trình tự gen theo phƣơng pháp Sanger 91 3. Phân tích biến đổi di truyền một số gen liên quan cơ chế tác động của dioxin thông qua thụ thể AhR .98 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .99 TÀI LIỆU THAM KHẢO .100 2 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Phần viết tắt Phần viết đầy đủ, nghĩa tiếng Việt AhR Aryl hydrocarbon Receptor AhRR Aryl hydrocarbon Receptor Repressor AIP Aryl hydrocarbon Receptor Interacting Protein ARNT Aryl hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator Bp Base pair (Cặp bazơ) cDNA Coding Deoxyribonucleic acid (DNA mã hóa) CYP Cytochrome Cs Cộng sự dbSNP Single Nucleotide Polymorphism Database (Cơ sở dữ liệu đa hình đơn nucleotide) DNA Deoxyribonucleic acid HET Heterozygote (Dị hợp tử) HGVD Human Genetic Variation Database (Dữ liệu biến thể di truyền ngƣời) HOM Homozygote (Đồng hợp tử) HSP90 90-kDa Heat Shock Protein (Protein sốc nhiệt có khối lƣợng phân tử 90 kDa) kDa Kilodalton NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm Quốc gia về Thông tin công nghệ sinh học NGS Next Generation Sequencing (Giải trình tự thế hệ mới) PAH Polycyclic Aromatic Hydrocarbon (Hydrocarbon thơm đa vòng) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi Polymerase) PDB Protein Data Bank (Ngân hàng dữ liệu protein) 3 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com ppt Part per trillion (Phần nghìn tỷ) RNA Ribonucleic acid ROS Reactive Oxygen Species (Gốc tự do oxy hóa) rs Reference single nucleotide polymorphism TCDD 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin WES Whole exome sequencing (Giải trình tự toàn bộ exome; Giải trình tự toàn bộ hệ gen biểu hiện) WGS Whole genome sequencing (Giải trình tự toàn bộ hệ gen) WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới) XRE Xenobiotic Response Element (Yếu tố đáp ứng chất lạ sinh học) 4 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 2.1 Trình tự các cặp mồi khuếch đại 11 exon gen AhR .2 Trình tự các cặp mồi khuếch đại 6 exon gen AIP .3 Thành phần phản ứng PCR .4 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR .1 Phân nhóm đối tƣợng nghiên cứu ……………………………….2 Các bệnh liên quan dioxin có trong nhóm 1 ……………………. Tuổi của đối tƣợng nghiên cứu ………………………………….

Giới tính của đối tƣợng nghiên cứu ……………………………… 54 Bảng 3. Chỉ số khối cơ thể (BMI) của đối tƣợng phơi nhiễm dioxin ……. Các đa hình gen AhR phát hiện trong nghiên cứu ………………. So sánh tần suất các đa hình gen AhR trong nghiên cứu, tƣơng 61 ứng với đa hình ở các quần thể ngƣời trên thế giới (theo HGVD) Bảng 3.

Tần suất allele, kiểu gen các đa hình exon 10 gen AhR …………… 64 Bảng 3. Phân bố tần suất allele, kiểu gen của đa hình rs2066853 gen AhR trong nghiên cứu, so sánh với các quần thể ngƣời trên thế giới (theo HGVD) ……………………………………………………. Tần suất các kiểu gen (GG, GA, AA) của đa hình rs2066853 gen AhR ở ba nhóm vùng phơi nhiễm dioxin …………………… 68 Bảng 3. Tần suất kiểu gen GG và GA của đa hình rs2066853 gen AhR ở nhóm 1 và nhóm 2 vùng phơi nhiễm dioxin …………………….12 Phân bố tần suất allele và kiểu gen đa hình rs75519181 gen AhR trong nghiên cứu, so sánh với các quần thể ngƣời trên thế giới (theo HGVD) …………………………………………………….13 Các đa hình gen AIP phát hiện trong nghiên cứu ……………….

Tần suất allele, kiểu gen của 3 đa hình gen AIP trong nghiên cứu 78 5 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.15 So sánh tần suất đa hình gen AIP trong nghiên cứu, tƣơng ứng với đa hình ở các quần thể ngƣời trên thế giới (theo HGVD)…… 79 Bảng 3. Phân bố tần suất allele và kiểu gen đa hình rs2276020 gen AIP trong nghiên cứu, so sánh với các quần thể ngƣời trên thế giới (theo HGVD) ……………………………………………………. Phân bố tần suất allele và kiểu gen đa hình rs641081 gen AIP trong nghiên cứu, so sánh với các quần thể ngƣời trên thế giới (theo HGVD) …………………………………………………….18 Biến thể di truyền sàng lọc từ kết quả giải trình tự toàn bộ hệ gen biểu hiện (WES) ngƣời có nồng độ dioxin trong máu cao 88 6 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Sơ đồ các vùng chức năng của thụ thể AhR .2 Sơ đồ con đƣờng tín hiệu cổ điển thông qua thụ thể AhR .3 Sơ đồ các con đƣờng tín hiệu cổ điển và không cổ điển thông qua thụ thể AhR …………………………………………………….4 Sơ đồ cơ chế tác động gây hậu quả của dioxin ………………….5 Sơ đồ vị trí và cấu trúc gen AhR ……………………………….6 Sơ đồ vị trí và cấu trúc gen AIP ……………………………….7 Cấu trúc protein AIP …………………………………………….8 Sơ đồ mạng lƣới tƣơng tác của protein AIP …………………….1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu ……………………………………….1 Phân bố đối tƣợng nghiên cứu theo chỉ số BMI………………….2 Ảnh điện di đồ DNA tổng số …….3 Ảnh điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại 11 exon gen AhR 57 Hình 3.4 Ảnh điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại 6 exon gen AIP 58 Hình 3.5 Sơ đồ cấu trúc gen AhR và vị trí các đa hình trên gen AhR phát hiện trong nghiên cứu ………………………………………….6 Kết quả giải trình tự đoạn gen AhR có đa hình c.7 Phân bố tần suất đa hình rs3802082 trong nghiên cứu và ở các quần thể ngƣời trên thế giới (theo HGVD - Human Genetic Variation).8 Kết quả giải trình tự đoạn gen AhR có đa hình c.9 Kết quả giải trình tự đoạn gen AhR có đa hình c.10 Phân bố các kiểu gen của đa hình rs2066853 gen AhR ở nhóm phơi nhiễm và không phơi nhiễm dioxin ……………………….11 Phân bố kiểu gen GG và GA đa hình rs2066853 gen AhR ở các đối tƣợng có dioxin trong máu cao (ung thƣ và không ung thƣ) …….12 Kết quả giải trình tự đoạn gen AhR có đa hình c.N487D) 73 7 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.13 Kết quả giải trình tự đoạn gen AhR có đa hình c.14 Sơ đồ cấu trúc gen AIP và các vị trí biến đổi đƣợc phát hiện trong nghiên cứu ……………………………………………….15 Kết quả giải trình tự đoạn gen AIP chứa các biến đổi exon 2 …….16 Mô phỏng thay đổi trong cấu trúc protein AIP của đột biến mới c.17 Kết quả trình tự đoạn gen AIP có đa hình c.18 Mô phỏng thay đổi cấu trúc protein AIP của đa hình c.19 Kết quả giải trình tự đoạn gen AIP có đa hình c.20 Kết quả giải trình tự đoạn gen AIP có đa hình c.Q228K) 85 8 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com MỞ ĐẦU Dioxin là một trong số các chất ô nhiễm môi trƣờng, gây tổn thƣơng đa dạng và phức tạp đối với cơ thể con ngƣời, làm phát sinh nhiều bệnh lý đặc biệt là ung thƣ. Ngày nay, ô nhiễm dioxin do tồn lƣu sau chiến tranh và phát sinh từ các hoạt động sống của con ngƣời.

Aryl hydrocarbon Receptor (AhR) là thụ thể chuyên biệt cho hydrocarbon thơm, trong đó có dioxin và nhiều chất độc hại từ môi trƣờng, gọi chung là phối tử (ligand). Khi AhR đƣợc hoạt hóa bởi phối tử, gây điều hòa biểu hiện các gen tham gia nhiều quá trình sinh lý quan trọng của cơ thể nhƣ: trao đổi chất và giải độc, đáp ứng miễn dịch, sinh trƣởng tế bào, tăng sinh tế bào, chết tế bào theo chƣơng trình.Các cá thể khác nhau, mặc dù phơi nhiễm với các chất độc hại từ môi trƣờng nhƣ nhau, nhƣng lại chịu ảnh hƣởng cũng nhƣ có nguy cơ với ung thƣ là khác nhau, điều này có liên quan đến đa hình các gen AhR và AIP (Aryl hydrocarbon receptor Interacting Protein), là những gen quan trọng trong con đƣờng chuyển hóa các chất ngoại sinh. Do vậy, nghiên cứu đa hình gen AhR và AIP ở những ngƣời phơi nhiễm dioxin là cần thiết, làm cơ sở cho các nghiên cứu về ảnh hƣởng của dioxin và các chất ô nhiễm môi trƣờng ở mức phân tử, đặc biệt trong bối cảnh đánh giá nguy cơ sức khỏe con ngƣời sống trong môi trƣờng phơi nhiễm dioxin và các chất ô nhiễm môi trƣờng độc hại. Trên thế giới, các nghiên cứu về gen AhR và AIP chủ yếu trên ngƣời không phơi nhiễm dioxin.

Nghiên cứu ảnh hƣởng mức độ phân tử của dioxin phần lớn trên mô hình động vật thực nghiệm và tế bào nuôi cấy, đánh giá cơ chế tác động thông qua gây độc dioxin cấp tính, trong thời gian ngắn, chƣa có nhiều nghiên cứu trên các đối tƣợng bị phơi nhiễm dioxin trong thời gian dài.