Luận án: Sản xuất gam chuẩn RT-PCR ứng dụng chẩn đoán cúm, kiểm định vắc xin sởi - Nguyễn Thị Thường

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THƯỜNG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CÁC GAM CHUẨN CHO RT-PCR ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN CÚM VÀ KIỂM ĐỊNH CÔNG HIỆU VẮC XIN SỞI LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI – NĂM 2014 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THƯỜNG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CÁC GAM CHUẨN CHO RT-PCR ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN CÚM VÀ KIỂM ĐỊNH CÔNG HIỆU VẮC XIN SỞI Chuyên ngành: Vi sinh Y học Mã số: 62720115 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. Huỳnh Phương Liên 2. Nguyễn Trần Hiển HÀ NỘI – NĂM 2014 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lêi c¶m ¬n Tôi xin phép được gửi những lời cảm ơn sâu sắc tới Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau đại học, Bộ môn vi sinh vật Y học trường Đại học Y Hà Nội, Ban Giám đốc, Khoa Virus - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành Luận án này. Tôi xin cảm ơn Bộ Y tế đã phê duyệt và cấp kinh phí cho đề tài tuyển chọn “Nghiên cứu sản xuất bộ mẫu chuẩn RNA in vitro và đánh giá kết quả trên thực địa” cho nhóm nghiên cứu của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương mà một phần kết quả của đề tài được trình bày trong Luận án.

Tôi xin cảm ơn Viện Pasteur Paris, Cộng hòa Pháp đã cho tôi tham gia khóa học về Vắc xin học và Miễn dịch học để giúp tôi hoàn thành Luận án thuận lợi hơn và cung cấp cho tôi nhiều hình ảnh minh họa trình bày trong Luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn GS. Huỳnh Phương Liên, là giáo viên chính, đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành Luận án này. Tôi xin trân trọng cảm ơn GS.

Nguyễn Trần Hiển, là giáo viên hướng dẫn, đã tạo mọi điều kiện và cho phép tôi tham gia Dự án SISEA để nâng cao năng lực nghiên cứu sản xuất chứng dương RNA và nghiên cứu về 18 tác nhân virus đường hô hấp cũng như cung cấp hầu hết kinh phí và toàn bộ trang thiết bị cho nghiên cứu của Luận án này. Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS. Nguyễn Đăng Hiền, Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu và Sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (POLYVAC) đã cung cấp cho tôi hơn 700 liều vắc xin sởi đơn sản xuất trong 4 năm (2010-2013) để tôi thực hiện nghiên cứu. Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.

Lê Văn Phủng, trưởng Bộ môn Vi sinh Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi tham gia học một số khóa học liên quan đến mẫu chuẩn, xuất xưởng vắc xin và thẩm định phương pháp do Tổ LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com chức Y tế Thế giới tổ chức để tôi có thể thực hiện được phần phân tích thẩm định phương pháp của Luận án này. Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô giáo của Bộ môn Vi sinh Trường Đại học Y Hà Nội đã hướng dẫn cho tôi các Học phần Tiến sỹ, Chuyên đề Tiến sỹ và Tiểu luận Tổng quan Tiến sỹ cũng như toàn thể cán bộ của Bộ môn đã động viên, tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành Luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Phạm Hồng Nhung, giáo vụ Sau Đại học Bộ môn Vi sinh Trường Đại học Y Hà Nội đã hết sức nhiệt tình, có trách nhiệm, động viên, chan hòa, và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành Luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Fitzmaurice đã hiệu đính bản Tóm tắt luận án tiếng Anh. Tôi xin trân trọng cảm ơn toàn thể cán bộ phòng thí nghiệm các virus herpes mà nay là phòng thí nghiệm virus viêm gan và các cán bộ của Dự án SISEA, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã thực hiện nghiêm túc và hợp tác cùng tôi để có được kết quả nghiên cứu của Dự án mà một phần được trình bày trong Luận án này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp đã luôn động viên, dõi theo các bước tiến và chia xẻ với tôi nhiều vui buồn trong cuộc sống và công việc.

Sau cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới mẹ và gia đình đã cho tôi cuộc sống này, nuôi dưỡng, bao bọc và dạy tôi biết sống tốt, thẳng thắn, và yêu công việc. Hà Nội, tháng 10 năm 2014 Nghiên cứu sinh BS. Nguyễn Thị Thường LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CAM ĐOAN Tôi là NGUYỄN THỊ THƯỜNG, nghiên cứu sinh khóa 27, Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Vi sinh Y học, xin cam đoan: 1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của GS.

Huỳnh Phương Liên và GS. Nguyễn Trần Hiển. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này. Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Bs. Nguyễn Thị Thường LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN A. Antibody-dependent cellular cytotoxicity (Đáp ứng miễn dịch gây độc qua trung gian tế bào phụ thuộc kháng thể) ARN.

Ribonucleic acid (Acid ribonucleic ) ADN. Deoxyribonucleic acid (Acid deoxyribonucleic) CDC. Centers for disease control and prevention (Trung tâm Phòng và Kiểm soát Bệnh tật) CEF. Chicken embryonic fibroblast (Nguyên bào sợi phôi gà) CMV.

Correlate of protection (Yếu tố bảo vệ) CPE:. Cytopathic effects (Hủy hoại tế bào) Ct. Threshold cycle (Chu kỳ ngưỡng) CV. Coefficient of variation (Hệ số biến thiên) EDTA.

Ethylenediamin tetraacetic acid ELISA. Enzyme-linked immunosorbent assay (Thử nghiệm miễn dịch hấp phụ gắn enzyme) EQA. External quality assessment (Chương trình đánh giá chất lượng từ bên ngoài) FCS. Fetal calf serum (Huyết thanh bê bào thai) FDA.

French development agency (Cơ quan Phát triển Pháp) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Human adenovirus (Virus adeno gây bệnh ở người) hCoV. Human coronavirus (Virus corona gây bệnh ở người) HIV. Human immunodeficiency virus (Virus gây suy giảm miễn dịch ở người) HI.

Haemagglutination inhibition (Ức chế ngưng kết hồng cầu) hMPV. Human metapneumovirus (Virus gây viêm phổi ở người) HPV. Human papillomavirus (Virus gây u nhú ở người) hRSV. Human respiratory syncytial virus) (Virus hợp bào hô hấp) HRV.

Human rhinovirus (Virus rhino gây bệnh ở người) hSLAM. Human signaling lymphocyte activation marker (Phân tử dấu ấn tín hiệu hoạt hóa tế bào lympho ở người) HSV. Herpes simplex virus (Virus herpes simplex) IFA. Immunofluorescence assay (Thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang) ILI.

Influenza-like illness (Bệnh tương tự cúm/hội chứng cúm) IQC. Internal quality control (Chương trình nội kiểm) ISO. International standard organization (Tổ chức Tiêu chuẩn quốc tế) Log. Logarit (cơ số 10) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Madin-Darby canine kidney (Tế bào thường trực thận chó) MMR. Measles - Mumps - Rubella (Sởi - Quai bị - Rubella) NAT:. Nucleic acid testing (Xét nghiệm acid nucleic) NCBI. National center for biotechnology information (Trung tâm quốc gia về thông tin công nghệ sinh học) NIH.

National institute of health (Viện Sức khỏe quốc gia) NK. Natural killer (Tế bào diệt tự nhiên) OD. Optical density (Mật độ quang) OMV. Outer membrance vesicle (Túi màng ngoài/vô bào) OPV.

Oral polio vaccine (Vắc xin bại liệt uống) PCR. Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) pdm. Plaque forming unit (Đơn vị tạo đám hoại tử) QA. Quality assurance (Đảm bảo chất lượng) QC.

Quality control (Kiểm soát chất lượng) RFLP. Restriction fragments length polymorphism (Phản ứng đa dạng chiều dài đoạn cắt enzyme giới hạn) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Rougeole - Oreillons - Rubéole (Sởi - Quai bị - Rubella) RT-PCR. Reverse transcriptase polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược) SA.

Sialic acid (Acid sialic) SARI. Severe acute respiratory infection (Viêm đường hô hấp cấp tính nặng) SDS. Sodium dodecyl sulfate SISEA. Surveillance and investigation of endemic situations in South-East Asia (Giám sát và điều tra tình hình dịch ở Đông Nam Á) SOP.

Standard operating procedures (Quy trình thực hành chuẩn) SVP. Severe viral pneumonia (Viêm phổi nặng do virus) T. Tissue culture infectivity dose (Liều gây nhiễm 50% nuôi cấy tế bào) Vero. Verda reno (Tế bào thận khỉ xanh Châu Phi) VLP.

Viral-like particle (Phần tử tương tự hạt virus) VZV. Varicella-Zoster virus WHO. World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ. Tổng quan một số vấn đề về cúm.

Phép gọi tên. Hình thái, cấu trúc. Kháng nguyên và tính đa dạng chủng. Sự nhân lên của virus cúm.

Dịch tễ học. Chẩn đoán phòng thí nghiệm. Tình hình nghiên cứu về cúm và tỷ lệ nhiễm cúm. Tổng quan một số vấn đề về sởi.

Phép gọi tên. Hình thái, cấu trúc. Sự nhân lên của virus. Các triển vọng thanh toán sởi.

Các nghiên cứu liên quan đến sởi. Sản xuất chứng dương ARN in vitro và kiểm định công hiệu vắc xin. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Đối tượng nghiên cứu.

Vật liệu nghiên cứu. Cơ sở vật chất và trang thiết bị, máy móc. Sinh phẩm hóa chất. Mồi và đầu dò.

Phần mềm phân tích và nguồn thông tin. Phương pháp nghiên cứu. Sản xuất chứng dương ARN in vitro. 49 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Xác định tỷ lệ nhiễm cúm. Xây dựng phương pháp kiểm định vắc xin sởi. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. Sản xuất chứng dương ARN.

Tạo khuôn mẫu cho phương pháp phiên mã cổ điển. Tạo khuôn mẫu cho phương pháp phiên mã trực tiếp. Xác định tỷ lệ nhiễm cúm bằng RT-PCR. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu.

Đặc điểm trường hợp tử vong do cúm. Ứng dụng chứng dương trong xác định tỷ lệ nhiễm cúm. Tỷ lệ đồng nhiễm cúm và các virus khác. Phân bố nhiễm cúm theo giới tính, nhóm tuổi và thời gian.

Kiểm định công hiệu vắc xin sởi. Công hiệu vắc xin mẫu chuẩn bằng tạo đám hoại tử. Công hiệu vắc xin mẫu chuẩn bằng real-time RT-PCR. Sự ổn định của ARN tách chiết bằng TpLR.

Công hiệu vắc xin sởi thành phẩm. Độ lặp lại của phản ứng. Kết quả sản xuất các gam chuẩn. Tạo dòng plasmid tái tổ hợp và chuyển nạp.

Kiểm tra chuyển nạp. Tạo mạch thẳng ADN plasmid bằng cắt enzyme giới hạn .