Xây dựng quy trình phát hiện, định lượng mRNA E6 HPV 16 gây ung thư cổ tử cung bằng Real-time RT PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  CHUYÊN ĐỀ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG SỰ BIỂU HIỆN mRNA E6 CỦA HUMAN PAPILLOMA VIRUS TYPE 16 GÂY BỆNH UNG THƯ CỔ TỬ CUNG BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME RT PCR NG ƯỜI H ƯỚNG DẪN : TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY Th.S TRƯƠNG KIM PHƯỢNG SINH VIÊN TH Ự C HI ỆN : ĐINH VŨ HỒNG VÂN MSSV: 30560693 KHOÁ 2005-2009 LÔØI CAÛM ÔN Nhöõng lôøi caûm ôn chaân thaønh vaø saâu saéc nhaát xin ñöôïc daønh ñeán: Cha meï ñaõ cho con tình thöông, luoân taïo ñieàu kieän toát nhaát veà vaät chaát vaø tinh thaàn ñeå con coù theå hoaøn thaønh toát ñeà taøi baùo caùo naøy. Leâ Huyeàn AÙi Thuyù ñaõ taän tình höôùng daãn cho em hoaøn thaønh toát nhaát ñeà taøi baùo caùo naøy. Coâ Leâ Thò Truùc Linh, Coâ Tröông Kim Phöôïng – nhöõng ngöôøi ñaõ hoã trôï, giuùp ñôõ em trong suoát thôøi gian qua.

Anh Phan Quoác Vieät, chị Hoà Thò Thanh Thuyû, anh Nguyeãn Vaên Höng vaø taäp theå caùc anh chò trong Coâng ty Coå phaàn Thöông maïi vaø Dòch vuï Vieät AÙ ñaõ taïo moïi ñieàu kieän vaø giuùp ñôõ em nhieät tình trong thôøi gian em thöïc hieän ñeà taøi taïi coâng ty. Cuoái cuøng, xin gôûi ñeán caùc baïn – nhöõng ngöôøi ñaõ ñoàng haønh cuøng toâi gaén boù, chia seû moïi khoù khaên cuõng nhö thaønh coâng lôøi caûm ôn chaân thaønh nhaát. TÓM TẮT Ung thư cổ tử cung được xem là căn bệnh nguy hiểm với tỷ lệ tử vong đứng hàng thứ hai trong các bệnh ung thư ở phụ nữ, chỉ sau ung thư vú. Đây là dạng ung thư có thể chữa khỏi nếu được phát hiện kịp thời.

Nguyên nhân chính gây ra bệnh này là virus human papilloma (HPV), đặc biệt là HPV type 16 và 18. Bình thường, sự xâm nhiễm của HPV chưa đủ để gây ra ung thư mà chỉ khi nào HPV có sự gắn chèn lên bộ gene người, chúng mới biểu hiện khả năng đó. Một trong những hệ quả của sự gắn chèn này là sự phiên mã và dịch mã của hai oncogene E6 và E7. Nghiên cứu của chúng tôi nhằm vào hiện tượng phiên mã, nói cách khác là sự biểu hiện của một trong hai oncogene dưới hình thức mRNA E6.

Bước đầu chúng tôi đã thành công trong việc xây dựng quy trình phát hiện và định lượng sự biểu hiện của mRNA E6 có trong mẫu bệnh phẩm (đã có kết quả dương tính với Pap’smear) bằng kỹ thuật Real - time RT PCR. Hệ primer - probe đặc hiệu cho gene E6 của chủng HPV type 16 đã được sử dụng và cho sản phẩm khuếch đại là 81bp. Quy trình cũng đã được thử nghiệm trên hai mươi mẫu bệnh phẩm (đã có kết quả xác định nhiễm HPV type 16). Kết quả ghi nhận được có hai trong hai mươi trường hợp xuất hiện sự gắn chèn.

Với kết quả đạt được ban đầu, chúng tôi nghĩ quy trình nên được thử nghiệm với một lượng bệnh phẩm lớn hơn để có thể ứng dụng quy trình trong phát hiện sớm và theo dõi tiến triển của xâm nhiễm HPV sang ung thư cổ tử cung. MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU. TỔNG QUAN TÀI LIỆU I. ĐỊNH NGHĨA UNG THƯ CỔ TỬ CUNG.

TÁC NHÂN GÂY UNG THƯ CỔ TỬ CUNG. Sự xâm nhiễm về mặt phân tử. TÌNH HÌNH BỆNH UNG THƯ CỔ TỬ CUNG TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM. Tình hình trên thế giới.

Tình hình ở Việt Nam. PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH UNG THƯ CỔ TỬ CUNG. Chẩn đoán lâm sàng. Các phương pháp chẩn đoán phòng thì nghiệm bệnh ung thư cổ tử cung.

Xét nghiệm tế bào học. Xét nghiệm tìm HPV DNA. HPV DNA PCR. HPV DNA Hybrid Capture (HC2 test).

Phương pháp Southern blot. PHƯƠNG PHÁP PCR VÀ ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH UNG THƯ CỔ TỬ CUNG. Các thành phần trong phản ứng PCR. Phương pháp PCR không truyền thống.

Real - time PCR. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP I. VẬT LIỆU THIẾT BỊ. Vật liệu – hoá chất.

Vật liệu sinh học. Hoá chất dùng cho tách chiết DNA. Hoá chất dùng cho một phản ứng PCR. Hoá chất dùng cho điện di trên thạch và thang agarose.

Dụng cụ thiết bị. PHƯƠNG PHÁP. Phương pháp thiết kế primer. Các phần mềm sử dụng.

Phương pháp tiến hành. Phương pháp tách chiết DNA/RNA. Cách tiến hành. Phương pháp PCR.

Cách tiến hành phản ứng Real time RT - PCR. 30 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN I. THIẾT KẾ MỒI VÀ MẪU DÒ TRÊN GENE E6 HPV TYPE 16. Kết quả chạy clustal hệ primer-probe vừa thiết kế.

Kết quả chạy annhyb cho hệ primer-probe. ĐÁNH GIÁ HỆ MỒI & MẪU DÒ CHO GENE E6, HPV TYPE 16 VỪA THIẾT KẾ. Tính đặc hiệu. Thành phần nucleotide.

Nhiệt độ nóng chảy. Cấu trúc thứ cấp. KẾT QUẢ THIẾT KẾ CHƯƠNG TRÌNH REAL-TIME RT PCR. Đối với RT.

Đối với Real - time PCR. Xây dựng quy trình. Kiểm tra khả năng hoạt động của hệ primer, probe trên gene E6 HPV type 16 bằng Real - time PCR. Kết quả tách chiết RNA.

Khảo sát nhiệt độ lai của hệ primer, probe. Khảo sát độ nhạy của toàn bộ quy trình. ỨNG DỤNG QUY TRÌNH TRÊN CÁC MẪU BỆNH PHẨM 46 1. Quy trình tách chiết và Real time RT – PCR.

Quy trình Real - time PCR. 48 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ I. 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 61 DANH MỤC HÌNH ẢNH Trang Hình 1: Cận cảnh cổ tử cung cho thấy sự phát triển của các tế bào bất thường trong bệnh ung thư CTC.

4 Hình 2: Virus HPV. 5 Hình 3: Bộ gene HPV. 5 Hình 4: Quá trình xâm nhiễm và gây bệnh của HPV trong tế bào chủ 7 Hình 5: Diễn tiến của hiện tượng chèn gene E6 và E7 vào trong bộ gene chủ. 8 Hình 6: Sơ đồ biểu diễn phân bố tỉ lệ bị ung thư CTC trên thế giới.

10 Hình 7: Đồ thị biểu diễn độ tuổi và so sánh tình trạng tử vong do ung thư CTC giữa các nước đang phát triển và các nước phát triển. 10 Hình 8: Biểu đồ phân bố tỉ lệ KCTC ở các nước vùng Châu Á – Thái Bình Dương. 11 Hình 9: Biểu đồ tỉ lệ nhiễm HPV ở các trường hợp có tổn thương tế bào HSIL (CIN 2/3). 12 Hình 10: Xét nghiệm tế bào học.

13 Hình 11: Quá trình phát tín hiệu huỳnh quang của Molecular beacon. 19 Hình 12: Cơ chế phát huỳnh quang của chất nhuộm SYBR Green I 20 Hình 13: Cơ chế phát tín hiệu huỳnh quang của probe đôi. 20 Hình 14: Phương pháp Taqman probe. 21 Hình 15: Thang 100bp.

26 Hình 16: Chương trình luân nhiệt của phản ứng Real - time PCR. 34 Hình 17: Kết quả của việc tìm độ tương đồng trên gene E6 và primer xuôi bằng chương trình clustal. 36 Hình 18: Kết quả của việc tìm độ tương đồng trên gene E6 và primer ngược bằng chương trình clustal. 37 Hình 19: Kết quả của việc tìm độ tương đồng trên gene E6 và probe bằng chương trình clustal.

37 Hình 20: Kết quả của việc đánh giá primer, probe bằng annhyb (3 chỗ có màu hồng là vị trí của nu thay thế). 38 Hình 21: Chu trình luân nhiệt của phản ứng RT. 43 Hình 22: Chu trình luân nhiệt của phản ứng Real - time PCR. 43 Hình 23: Đường cong biểu diễn sự hoạt động của hệ primer – probe của gene E6 HPV type 16 trên mẫu bệnh phẩm A.

44 Hình 24: Kết quả kiểm tra quy trình tách chiết RNA trên 5 mẫu dương tính với HPV type 16. 45 Hình 25: Kết quả Real-time PCR trên mẫu bệnh phẩm C sau khi xử lý với DNase I. 47 Hình 26: Kết quả khảo sát nhiệt độ lai của hệ primer probe trên gene E6 HPV type 16. 48 Hình 27: Đường cong biểu diễn độ nhạy của hệ primer – probe trên gene E6 HPV type 16 trên mẫu bệnh phẩm F.

49 Hình 28: Chu trình luân nhiệt của phản ứng Real - time PCR trong thực nghiệm. 51 Hình 29: Đường cong biểu diễn sự hoạt động của hệ primer – probe trên gene E6 HPV type 16 trên 20 mẫu bệnh phẩm. 5 DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1: Tỷ lệ tiến triển của các giai đoạn CIN sang ung thư CTC. 9 Bảng 2: Trình tự hệ mồi – mẫu dò trên gene E6 của HPV type 16.

33 Bảng 3: Kết quả chạy Real - time PCR trên 5 mẫu và chu kỳ dương tính của từng mẫu. 41 Bảng 4: Kết quả xử lý mẫu C với enzyme DNase I. 43 Bảng 5: Kết quả khảo sát độ nhạy của hệ primer – probe theo gradient từ 102 đến 108. 46 Bảng 6: Kết quả định tính và định lượng mRNA E6 trên 20 mẫu bệnh phẩm dương tính với HPV type 16.

49 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ▪ HPV: Human papillomavirus ▪ RT: reverse transciptase ▪ PCR: polymerase chain reaction ▪ CTC: cổ tử cung ▪ DNA: deoxyribonucleic acid ▪ RNA: ribonucleic acid ▪ mRNA: messenger ribonucleic acid ▪ AIDS: Acquired Immune Deficiency Syndrome ▪ E: early ▪ L: late ▪ bp: base pair ▪ EPI: episome ▪ ORF: open reading frame ▪ HR: high risk ▪ LR: low risk ▪ CIN: cervical intraepithelial neoplasia ▪ hTERT: Human Telomerase Reverse Transcriptase ▪ IARC: International Agenecy For Research on Cancer ▪ HSIL: high squamous intraepithelial lession ▪ LSIL: low squamous intraepithelial lession ▪ Pap’smear: Papanicolaou smear ▪ HC2: Hybrid capture 2 ▪ dNTPs: deoxynucleotide triphosphates ▪ DMSO: dimethinsulfoxide ▪ cDNA: complementary DNA ▪ TE: Tris EDTA ▪ EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid ▪ DEPC: Diethylpyrocarbonate ▪ TAE: Tris acetate EDTA ▪ BLAST: Basic Local Alignment Search Tool ▪ EMBL: European Molecular Biology Labolatories ▪ DDBJ: DNA Data Bank of Japan ▪ nu: nucleotide ▪ Ct: Cycle Threshold ▪ FRET: Fluorescent Resonance Energy Transfer. ▪ DEPC: Diethylpyrocarbonate MỞ ĐẦU Human Papilomavirus (HPV: virus gây u nhú vùng sinh dục) là virus gây bệnh cho con người, đặc biệt là phụ nữ. Chúng là nguyên nhân gây ra mụn cơm, mụn cóc và các sùi mào gà ở da, dương vật, âm hộ, hậu môn,… dẫn đến viêm da lành tính, hoặc viêm cơ quan sinh dục dẫn đến vô sinh. Ở phụ nữ, HPV là nguyên nhân chính gây ra bệnh ung thư cổ tử cung (chiếm khoảng 97% trường hợp [44 – 47].

Đây là loại ung thư phụ nữ thường mắc phải, chỉ sau ung thư vú. Hàng năm trên thế giới có hơn nửa triệu phụ nữ bị ung thư cổ tử cung và trên 50% người bệnh tử vong do phát hiện bệnh ở giai đoạn muộn.