Luận án TS: Đa hình gen PDCD1, CD274 ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính - Phạm Thị Minh Huyền

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI PHẠM THỊ MINH HUYỀN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐA HÌNH ĐƠN GEN PDCD1 VÀ CD274 Ở BỆNH NHÂN NHIỄM VIRUS VIÊM GAN B MẠN TÍNH LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI ======== PHẠM THỊ MINH HUYỀN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐA HÌNH ĐƠN GEN PDCD1 VÀ CD274 Ở BỆNH NHÂN NHIỄM VIRUS VIÊM GAN B MẠN TÍNH Chuyên ngành : Hóa sinh y học Mã số : 9720101 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. Đặng Thị Ngọc Dung 2. Nghiêm Xuân Hoàn HÀ NỘI - 2022 LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình thực hiện đề tài này tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của lãnh đạo các cơ quan, thầy cô, đồng nghiệp, các bệnh nhân và gia đình thân yêu của mình. Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.

Đặng Thị Ngọc Dung- Bộ môn Hóa sinh trường Đại học Y Hà Nội và TS. Nghiêm Xuân Hoàn- Phó chủ nhiệm khoa Sinh học phân tử, Bệnh viện TWQĐ 108, là những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện nghiên cứu, đã tận tình giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài, góp ý và sửa chữa luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến quý thầy cô, đồng nghiệp, những người đã tạo mọi điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án này: Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại Học- trường Đại học Y Hà Nội. Toàn thể quý thầy cô, cán bộ trong Bộ môn Hóa Sinh- trường Đại học Y Hà Nội.

Ban giám đốc bệnh viện TWQĐ 108. Toàn thể quý thầy cô, cán bộ, sinh viên của Trung tâm nghiên cứu y học Việt Đức- Bệnh viện TWQĐ 108. Toàn thể các bác sỹ, dược sỹ, kỹ sư, kỹ thuật viên của Trung tâm xét nghiệm- Bệnh viện TWQĐ 108. Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới các bệnh nhân và gia đình của họ đã giúp tôi có được số liệu trong luận án này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới quỹ Phát triển khoa học và công nghệ quốc gia (Nafosted) đã hỗ trợ kinh phí cho nghiên cứu này. Kết quả nghiên cứu là một phần kết quả trong đề tài: “Nghiên cứu vai trò các phân tử ức chế điểm kiểm soát tín hiệu miễn dịch của con đường PD-1/PD-L1 và IDO/TDO-Kyn-AhR đối với hậu quả lâm sàng ở bệnh nhân nhiễm vi rút viêm gan B mạn tính”. Xin cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp đã giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS Đào Phương Giang- Trung tâm tư vấn di truyền và sàng lọc ung thư- Bệnh viện TWQĐ 108, BSNT Bùi Đình Tùng, BSNT Ngọ Thị Uyên- Bộ môn Hóa Sinh trường Đại học Y Hà Nội, CN Bùi Thùy Linh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.

Cuối cùng tôi xin ghi nhớ công ơn sinh thành, nuôi dưỡng, dạy dỗ, tình yêu thương của bố mẹ hai bên cùng sự ủng hộ, động viên của chồng tôi và của hai con và các anh chị em trong gia đình, những người đã luôn ở bên, là chỗ dựa vững chắc để tôi yên tâm học tập và hoàn thành luận án. Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Phạm Thị Minh Huyền LỜI CAM ĐOAN Tôi là Phạm Thị Minh Huyền, nghiên cứu sinh khóa 38 Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Hóa sinh Y học, xin cam đoan: 1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của cô PGS. Đặng Thị Ngọc Dung và thầy TS.

Nghiêm Xuân Hoàn. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này.

Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Người viết cam đoan Phạm Thị Minh Huyền MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU. ĐẠI CƯƠNG VỀ NHIỄM VIRUS VIÊM GAN B. Virus viêm gan B.

Sinh lý bệnh trong nhiễm virus viêm gan B. Đáp ứng miễn dịch trong nhiễm virus viêm gan B. Chẩn đoán và điều trị nhiễm virus viêm gan B. CON ĐƯỜNG TÍN HIỆU PD-1/PD-L1.

Tín hiệu thông qua con đường PD-1/ PD-L1. Vai trò của con đường PD-1/PD-L1 trong nhiễm virus viêm gan B mạn tính. Vai trò của con đường PD-1/PD-L1 trong ung thư gan. Ứng dụng con đường PD-1/ PD-L1 trong điều trị hiện nay.

ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTID CỦA GEN PDCD1, CD274 VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN HUYẾT TƯƠNG CỦA GEN PD-1, PD-L1. Khái niệm về đa hình đơn nucleotid. Đa hình đơn nucleotid của gen PDCD1. Đa hình đơn nucleotid của gen CD274.

Protein sPD-1, sPD-L1. 33 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU. Nhóm người khỏe mạnh.

Bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B mạn tính. Cỡ mẫu nghiên cứu. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Thiết kế nghiên cứu và sơ đồ nghiên cứu.

Nội dung nghiên cứu. Trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất nghiên cứu. Kỹ thuật phân tích đa hình đơn nucleotid gen PDCD1 và CD274. Kỹ thuật định lượng protein sPD-1 và sPD-L1.

XỬ LÝ VÀ PHÂN TÍCH SỐ LIỆU. ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU. CÁC BIỆN PHÁP KHỐNG CHẾ SAI SỐ TRONG NGHIÊN CỨU.

54 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU. Đặc điểm phân bố về tuổi của đối tượng nghiên cứu. Đặc điểm về giới của đối tượng nghiên cứu.

Đặc điểm cận lâm sàng ở nhóm bệnh nhân nhiễm HBV mạn. PHÂN BỐ KIỂU GEN VÀ ALEN CỦA CÁC BIẾN THỂ PD-1.9 VÀ rs2297136, rs4143815 Ở CÁC NHÓM NGHIÊN CỨU. PHÂN BỐ HAPLOTYPE Ở CÁC NHÓM NGHIÊN CỨU. Phân bố haplotype của 2 SNP trên exon 5 của gen PD-1 ở các nhóm nghiên cứu.

Phân bố haplotype của gen PD-1 ở các nhóm nghiên cứu. Phân bố haplotype của gen PD-L1 ở các nhóm nghiên cứu. NỒNG ĐỘ PROTEIN sPD-1 và sPD-L1. Nồng độ protein sPD-1.

Nồng độ protein sPD-L1. Tương quan giữa nồng độ sPD-1 và sPD-L1. MỐI LIÊN QUAN GIỮA KIỂU GEN VÀ NỒNG ĐỘ sPD-1, sPD-L1. Mối liên quan giữa kiểu gen PD-1 và nồng độ protein sPD-1.

Mối liên quan giữa kiểu gen PD-L1 với nồng độ protein sPD-L1. 86 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN. PHÂN BỐ KIỂU GEN VÀ ALEN CỦA MỘT SỐ ĐA HÌNH ĐƠN GEN PDCD1 VÀ CD274 Ở BỆNH NHÂN NHIỄM VIRUS VIÊM GAN B MẠN TÍNH VÀ NGƯỜI KHỎE MẠNH. MỐI LIÊN QUAN GIỮA MỘT SỐ ĐA HÌNH ĐƠN GEN PDCD1, CD274 VÀ NỒNG ĐỘ PROTEIN HUYẾT TƯƠNG sPD-1, sPD-L1 VỚI MỘT SỐ THỂ BỆNH LÂM SÀNG Ở BỆNH NHÂN NHIỄM VIRUS VIÊM GAN B MẠN TÍNH.

118 HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO. 120 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt a.a Amino acid Acid amin AHB Acute hepatitis B virus Viêm gan virus B cấp ALT Alanine transaminase APC Antigen presenting cell Tế bào trình diện kháng nguyên AST Aspartate transaminase cccDNA Covalently closed circular DNA dạng vòng DNA DC Dendritic cell Tế bào gai HBV Hepatitis B virus Virus viêm gan B HCC Hepatocellular cancer Ung thư biểu mô tế bào gan HCV Hepatitis C virus Virus viêm gan C INR International normalized ratio ITIM Immunoreceptor tyrosine- Motif ức chế phụ thuộc thụ thể based inhibitory motif tyrosine ITSM Immunoreceptor tyrosine- Motif chuyển phụ thuộc thụ thể based switch motif tyrosine LC Liver cirrhosis Xơ gan LCMV Lymphocytic chriomeningitis Virus gây viêm màng não virus lympho MHC Major Histocompatibility Phức hợp hòa hợp mô chủ yếu Complex mPD-1 membrane PD-1 Protein PD-1 dạng gắn màng mPD-L1 membrane PD-L1 Protein PD-L1 dạng gắn màng NA Nucleos(t)ide analogue Hoạt chất tương tự Nuclos(t)ide Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt NK Natural killer cell Tế bào giết tự nhiên NKT Natural killer T cell Tế bào T giết tự nhiên SNP Single nucleotide Đa hình đơn nucleotid polymorphism sPD-1 Soluble PD-1 Protein PD-1 dạng hòa tan sPD-L1 Soluble PD-L1 Protein PD-L1 dạng hòa tan VGMT Viêm gan mạn tính XG Xơ gan DANH MỤC BẢNG Bảng 2. Đánh giá chức năng gan theo Child - Pugh. Phân chia giai đoạn HCC theo BCLC.

Trình tự mồi của phản ứng PCR. Phân bố về tuổi ở các nhóm nghiên cứu. Phân bố giới tính của các nhóm nghiên cứu. Đặc điểm cận lâm sàng ở nhóm bệnh nhân nhiễm HBV mạn .1 ở nhóm bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B mạn tính và người khỏe mạnh .1 ở các nhóm bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B mạn.5 ở nhóm bệnh nhân nhiễm HBV mạn và người khỏe mạnh .5 ở các nhóm bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B mạn.9 ở nhóm bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B mạn tính và người khỏe mạn .9 ở các nhóm bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B mạn tính.

Đa hình rs2297136 ở nhóm bệnh nhân và người khỏe mạnh. Đa hình rs2297136 ở các nhóm bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B mạn. Đa hình rs4143815 ở nhóm bệnh nhân và người khỏe mạnh. Đa hình rs4143815 ở các nhóm bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B mạn.

Phân bố haplotype ở nhóm bệnh nhân nhiễm HBV mạn và nhóm người khỏe mạnh. Mối liên quan giữa các haplotype PD-1.9 với các thể bệnh của bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính. Phân bố haplotype ở nhóm người khỏe mạnh và nhóm nhiễm HBV mạn. Phân bố các haplotype điển hình ở các nhóm bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B mạn tính.

Mối liên quan haplotype PD-1.9 với các thể bệnh ở bệnh nhân nhiễm HBV mạn. Phân bố haplotype gen PD-L1 ở nhóm người khỏe mạnh và nhóm bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B mạn. 78 DANH MỤC HÌNH Hình 1. Cấu trúc phân tử của virus viêm gan B.

Các pha của nhiễm virus viêm gan B mạn tính. Tiến triển lâm sàng ở bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B. Đáp ứng miễn dịch trong nhiễm virus viêm gan B. Thuốc điều trị nhiễm HBV mạn tính đã được chấp nhận.

Tín hiệu PD-1 ức chế sự hoạt hóa của tế bào lympho T. Cấu trúc gen PD-1. Cấu trúc gen, mRNA và protein PD-L1. Nguyên lý phương pháp T- ARMS PCR.

Hình ảnh mô phỏng điện di sản phẩm PCR của đa hình rs2297136 sau phản ứng T- ARMS PCR. Hình ảnh mô phỏng điện di sản phẩm PCR của đa hình rs4143815 sau phản ứng T- ARMS PCR. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR PD-1. Hình ảnh đại diện giải trình tự gen xác định tính đa hình PD-1.