Luận án tiến sĩ: Hiệu quả đông phôi chậm vs thủy tinh hóa trong thụ tinh ống nghiệm

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Thành công của một quy trình thụ tinh trong ống nghiệm được thể hiện qua tỉ lệ mang thai. Hiện nay, xu hướng giảm số lượng phôi chuyển nhưng không làm giảm tỉ lệ mang thai. Việc lựa chọn phôi có chất lượng tốt nhất để chuyển, kết hợp với chương trình trữ lạnh sẽ giúp người bệnh tiết kiệm chi phí đáng kể, đồng thời góp phần cải thiện tỉ lệ thai cộng dồn trên một chu kỳ có kích thích buồng trứng và tăng tính an toàn của kỹ thuật điều trị. Theo thống kê của Van Voorhis (1995), trữ lạnh phôi có khả năng làm tăng tỉ lệ mang thai lên khoảng 6,6%, tính trên mỗi noãn thu được sau chọc hút và chi phí điều trị sẽ giảm 25-45% so với chu kì chuyển phôi tươi, bên cạnh đó kết quả sản khoa lại cao hơn hẳn[1],[2],[3],[4].

Đã có 2 phương pháp trữ lạnh được áp dụng là: Hạ nhiệt độ chậm và thủy tinh hóa. Sự khác biệt chính của 2 phương pháp này là tốc độ hạ nhiệt và nồng độ chất bảo quản. Hạ nhiệt độ chậm được Whittingham giới thiệu lần đầu tiên vào những năm đầu thập niên 70 trên mô hình phôi chuột. Em bé đầu tiên từ phôi người đông lạnh trên thế giới ra đời bằng phương pháp này được ghi nhận vào năm 1983 [5].

Trong phương pháp hạ nhiệt độ chậm, mẫu tế bào được làm lạnh với tốc độ hạ nhiệt chậm (1-30C/1 phút) từ nhiệt độ sinh lý xuống nhiệt độ rất thấp (khoảng - 800C) trước khi đưa mẫu vào lưu trữ trong ni - tơ lỏng. Ngoài ra, tốc độ rã đông cũng diễn ra chậm, quá trình xâm nhập và loại bỏ các chất bảo vệ đông lạnh (CPA) được diễn ra qua nhiều bước nhỏ. Do nồng độ các CPA sử dụng thấp và trải qua nhiều bước, tế bào tránh được sốc thẩm thấu gây ra bởi nồng độ CPA, đồng thời khả năng gây độc cho tế bào thấp. Vào năm 1985, Rall và Fahy đã chứng minh được phôi chuột có thể được đông lạnh thành công bằng một phương pháp mới, được gọi là thủy tinh hóa(non - equylibrium cryopreservation method) [6].

Em bé đầu tiên trên thế giới ra đời bằng kỹ thuật này được báo cáo vào năm 2002 (Liebermann và cs.,2002; Shaw và Jones,2003) [7], [8]. Trong kỹ thuật thủy tinh hóa, ba yếu tố quan trọng góp phần vào sự thành công của kỹ thuật là nồng độ của các CPA sử dụng, tốc độ hạ nhiệt/làm ấm và luan an 2 thể tích mẫu trữ lạnh (Vajta và Nagy, 2006), (Yahin và Arav, 2007) [9],[10]. Để có thể chuyển một lượng môi trường có chứa phôi từ dạng lỏng thành dạng "kính", các CPA cần phải được sử dụng ở nồng độ rất cao. Trong một thời gian khá dài, dù có những hạn chế về mặt hiệu quả nhưng hạ nhiệt độ chậm đã được xem là một phương pháp trữ lạnh chuẩn mực trong ngành công nghiệp chăn nuôi cũng như trong IVF trên người.

Trái lại, một khoảng thời gian dài sau khi được giới thiệu, thủy tinh hóa vẫn được xem là một kỹ thuật mang tính thử nghiệm vì nhiều lý do. Trong đó, lo ngại về các độc tính có thể có của việc sử dụng chất bảo quản nồng độ cao trên phôi và khó khăn trong việc thiết lập một hệ thống làm lạnh với tốc độ cao là những trở ngại chính. Vì vậy, cho đến nay, các nhà khoa học trên thế giới vẫn liên tục thực hiện các nghiên cứu so sánh ưu nhược điểm của 2 phương pháp, cũng như theo dõi sức khỏe, bệnh tật của những trẻ sinh ra từ 2 phương pháp trữ lạnh để đưa ra lựa chọn tối ưu an toàn. Tại trung tâm hỗ trợ sinh sản Quốc Gia, kỹ thuật đông lạnh chậm được thực hiện thành công năm 2002, thủy tinh hóa bắt đầu triển khai năm 2006, với phôi giai đoạn phân chia (phôi ngày 2 và phôi ngày 3).

Tại thời điểm nghiên cứu (2012- 2013), hầu hết các trung tâm hỗ trợ sinh sản ở Việt Nam, đều đã thực hiện thủy tinh hóa phôi mới và tiếp tục rã đông những phôi đã đông lạnh chậm. Tuy nhiên, chưa có một nghiên cứu theo dõi dọc nào tại Việt Nam, đánh giá hiệu quả các quy trình trữ lạnh thông qua các tiêu chí:tỷ lệ phôi sống, tỷ lệ có thai, tỉ lệ sinh sống, cũng như các yếu tố liên quan, tiên lượng kết quả có thai, theo dõi sự hình thành phát triển chiều cao, cân nặng, thể chất, trí tuệ, tâm vận động, bệnh tật từ khi sinh ra cho đến khi 4 tuổi để đưa ra tiên lượng cho sự phát triển tiếp theo cho những trẻ sinh ra từ 2 phương pháp này. Do đó chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu hiệu quả hai phương pháp đông phôi chậm và đông phôi thủy tinh hóa" với 2 mục tiêu: 1. Đánh giá đặc điểm phôi sau rã đông của hai phương pháp đông phôi chậm và đông phôi thủy tinh hóa.

Đánh giá một số yếu tố liên quan và tiên lượng của hai 2 phương pháp đông phôi chậm và đông phôi thủy tinh hóa. luan an 3 Chương 1 TỔNG QUAN 1. Những thay đổi bên trong tế bào trong quá trình trữ lạnh. Phản ứng của phôi khi cho vào môi trường có chứa CPA [9] (CPA: chất bảo vệ lạnh) A: Phôi 4 phôi bào B: Các phôi bào bị mất nước làm cho kích thước phôi co nhỏ (khi vừa tiếp xúc môi trường trữ lạnh).

C: Khi CPA đi vào bên trong phôi bào và thay thế lượng nước tế bào đã mất đi, lúc này kích thước của phôi được phục hồi. Nguyên lý của trữ lạnh là giảm nhiệt độ của môi trường chứa mẫu tế bào hay mẫu mô xuống nhiệt độ rất thấp, thường là 196ºC (nhiệt độ sôi của ni-tơ lỏng). Ở nhiệt độ thấp này, hầu hết các hoạt động sinh học bên trong tế bào bao gồm các phản ứng sinh hoá và các hoạt động trao đổi chất bị ngừng lại. Nhờ đó, tế bào sống ở dạng tiềm sinh (hybernate) và có thể bảo quản trong một thời gian rất dài.

Với điều kiện nhiệt độ thấp, các phân tử nước, các chất hoà tan trong môi trường xung quanh cũng như các vật chất bên trong tế bào tồn tại dưới dạng kết hợp (dạng tinh thể và dạng kính), do đó, không có bất kỳ yếu tố nào từ môi trường bên trong cũng như bên ngoài có thể tác động đến tế bào trong giai đoạn này. Tuy nhiên, nhiệt độ cơ thể của đa số các loài được kiểm soát chặt chẽ, nhất là ở các động vật có vú. Do đó, trong quá trình luan an 4 trữ lạnh, việc hạ nhiệt độ của tế bào về mức dưới 0ºC có thể đưa tế bào vào một môi trường không sinh lý. Hậu quả là các tổn thương có thể xảy ra trong tất cả các giai đoạn của quá trình hạ nhiệt độ.

Trong quá trình làm lạnh và rã đông, một số thay đổi trong môi trường chứa tế bào và cả trong bản thân tế bào có thể ảnh hưởng đến cấu trúc, chức năng, sự toàn vẹn và khả năng sống của tế bào sau khi rã đông. Một chu kỳ trữ lạnh thường trải qua ba giai đoạn quan trọng là (1) Đông lạnh: Đưa tế bào từ nhiệt độ sinh lý 37ºC xuống nhiệt độ rất thấp -196ºC. (2) Lưu trữ: Mẫu tế bào được bảo quản trong ni-tơ lỏng. (3) Rã đông: Đưa tế bào từ nhiệt độ thấp của ni-tơ lỏng về nhiệt độ sinh lý khi cần để tế bào tiếp tục phát triển.

Trong quá trình làm lạnh, tuỳ theo từng giai đoạn hạ nhiệt mà các tổn thương trên tế bào có thể khác nhau. Trong giai đoạn hạ nhiệt từ 15ºC đến -5ºC, các hạt lipid, các màng giàu lipid và các sợi vi ống bên trong tế bào có thể bị tổn thương [10]. Đây là những tổn thương không thể phục hồi khi đông lạnh noãn. So với những loài khác, các giọt lipid chứa trong tế bào noãn ở người tương đối thấp hơn.

Nhưng điều này cũng không loại trừ khả năng tổn thương ở tế bào noãn người trong quá trình đông lạnh. Mặt khác, khoảng nhiệt độ này có thể gây tổn thương màng và polymer hoá các vi ống, do đó sẽ làm rối loạn khả năng sắp xếp của các nhiễm sắc thể trên mặt phẳng xích đạo khi tế bào phân chia và kết quả là gây hiện tượng lệch bội trong quá trình phân chia của tế bào [12]. Một số ảnh hưởng khác mà khoảng nhiệt độ này gây ra cho tế bào thường được nhắc đến như việc giảm tốc độ hoạt động của các men (enzyme) sử dụng các quá trình chuyển hoá của tế bào. Nghiên cứu cho thấy khi nhiệt độ giảm từ 37ºC xuống 7ºC hoạt động của các men giảm 8 lần.

Tuy nhiên, ảnh hưởng của việc giảm hoạt động các men lên khả năng phát triển của tế bào sau này vẫn chưa được làm sáng tỏ [13]. Bên cạnh các khí hoà tan, môi trường nuôi cấy tế bào thường dùng khí CO 2 làm hệ đệm để cân bằng pH luan an 5 trong môi trường. Khi nhiệt độ hạ xuống thấp, các khí này không còn ở dạng hoà tan trong môi trường nữa mà tách ra tạo thành các bọt khí. Số lượng và kích thước của các bọt khí càng lớn thì việc chèn ép làm tổn thương đến cấu trúc trong tế bào càng nghiêm trọng [14].

Khi tế bào được làm lạnh từ -5ºC đến -15ºC hiện tượng hình thành tinh thể đá từ các phân tử nước tinh khiết trong môi trường sát bên ngoài tế bào (môi trường ngoại bào) và ngay bên trong tế bào (môi trường nội bào) sẽ xuất hiện. Sự hình thành các tinh thể đá có thể gây tổn thương cơ học lên màng tế bào và các bào quan bên trong. Đây là giai đoạn gây tổn thương lớn nhất và quan trọng nhất mà tế bào phải trải qua trong quá trình làm lạnh và rã đông [11]. Nước là thành phần chiếm thể tích lớn nhất bên trong tế bào cũng như ở môi trường bên ngoài tế bào.

Khi nhiệt độ càng giảm, số lượng phân tử nước chuyển thành tinh thể đá càng tăng, lượng nước ở thể lỏng giảm dần, hậu quả là nồng độ chất tan trong môi trường ngoại bào tăng gây mất cân bằng về áp lực thẩm thấu giữa tế bào với môi trường. Hậu quả là nước từ bên trong tế bào chất bị rút ra ngoài và kích thước tế bào trở nên co nhỏ. Nếu tế bào bị co nhỏ quá mức, sự tổn thương màng lipoprotein của tế bào xảy ra không thể phục hồi [15]. Tăng nhiệt độ tiềm tàng cũng là một hậu quả của sự hình thành các tinh thể đá.

Các phân tử nước khi chuyển sang thế rắn sẽ giải thoát ra một lượng nhiệt.