Luận án tiến sĩ y học: Định lượng steroid niệu bằng GC-MS chẩn đoán rối loạn sinh tổng hợp steroid bẩm sinh - Trần Thị Ngọc Anh, Trường Đại học Y Hà Nội

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI TRẦN THỊ NGỌC ANH Nghiªn cøu ®Þnh lîng steroid niÖu b»ng gc/ms trong chÈn ®o¸n rèi lo¹n sinh tæng hîp steroid bÈm sinh ë trÎ em LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI TRẦN THỊ NGỌC ANH Nghiªn cøu ®Þnh lîng steroid niÖu b»ng gc/ms trong chÈn ®o¸n rèi lo¹n sinh tæng hîp steroid bÈm sinh ë trÎ em Chuyên ngành : Hóa sinh Y học Mã số : 62720112 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. Trần Thị Chi Mai 2. Trần Minh Điển HÀ NỘI – 2019 LỜI CẢM ƠN Xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Bệnh viện Hữu Nghị Việt Đức, Ban Giám đốc Bệnh viện Nhi Trung ương, Ban Giám hiệu Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành khóa học nghiên cứu sinh và bảo vệ luận án tiến sỹ. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.

Trần Thị Chi Mai, PGS.TS Trần Minh Điển, những người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉnh sửa luận án, giúp đỡ và động viên em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu, hoàn thành luận án. Xin trân trọng cảm ơn các thầy cô Bộ môn Hóa Sinh-Trường Đại học Y Hà Nội, đã hướng dẫn, giảng dạy và đóng góp nhiều ý kiến quý báu để em hoàn thành luận án. Xin cảm ơn Phòng Quản lý Đào tạo Sau Đại học, các phòng ban trong nhà trường đã tạo điều kiện và giúp đỡ em hoàn thành quá trình học tập tại trường. Xin gửi lời cảm ơn tới các đồng nghiệp tại khoa Xét nghiệm Huyết học – Bệnh viện Hữu Nghị Việt Đức, các anh –chị khoa Hóa sinh và khoa Nội tiết – Chuyển hóa – Di truyền Bệnh viện Nhi trung ương đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong công việc, lấy mẫu và thực hiện kỹ thuật để tôi hoàn thành luận án.

Xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ, chia sẻ trong cuộc sống và trong công việc, giúp tôi hoàn thành khóa học. Xin cảm ơn tất cả người bệnh, các bé khỏe mạnh đã cung cấp mẫu bệnh phẩm để thực hiện đề tài nghiên cứu này. Xin trân trọng cảm ơn! Ngày 17 tháng 7 năm 2019 NCS. Trần Thị Ngọc Anh LỜI CAM ĐOAN Tôi là Trần Thị Ngọc Anh, nghiên cứu sinh khóa 34, Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Hóa sinh y học, xin cam đoan: 1.

Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của Tiến sĩ Trần Thị Chi Mai và Phó giáo sư- Tiến sĩ Trần Minh Điển, Phó Giám đốc Bệnh viện Nhi Trung ương. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam. Nghiên cứu định lượng steroid niệu bằng kỹ thuật sắc ký khí – khối phổ có giá trị trong chẩn đoán bệnh lý rối loạn sinh tổng hợp hormon steroid bẩm sinh ở trẻ em, được thực hiện lần đầu tại Việt Nam. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan, đã được xác nhận, chấp thuận của cơ sở nghiên cứu.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này. Hà Nội, ngày 17 tháng 7 năm 2019 NCS. Trần Thị Ngọc Anh CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt 3β-HSD 3β-Hydroxysteroid dehydrogenase 5α-DHT 5α-Dihydrotestosterone 5α-THF 5α-Tetrahydrocortisol 11OH An 11-Hydroxy androsterone 11OH Et 11-Hydroxy etiocholanolone 11β-OH 11β-Hydroxylase 11 Keto An 11-Ketoandrosterone 17β-HSD 17β- Hydroxysteroid dehydrogenase 17-OHP 17α-Hydroxyprogesterone 17OHPN 17-Hydroxypregnanolone 21-OH 21-Hydroxylase A’3 Androstenetriol ACTH Adrenocorticotropic hormone Hormon kích thượng thận ADN Acid deoxyribonucleic AME Apparent mineralocorticoid excess An Androsterone CLSI Clinical & Laboratory Viện tiêu chuẩn lâm sàng và xét Standards Institute nghiệm CMO Corticosterone methyl oxidase CXĐ Chưa xác định CV Coefficient variation Hệ số biến thiên DHEA Dehydroepiandosterone DOC Deoxycorticosterone EQA External qualificative assurance Ngoại kiểm chất lượng Et Etiocholanolone FSH Follice stimulating hormone Hormon kích noãn tố GC/MS Gas chromatography – mass Sắc ký khí – khối phổ spectrometry GnRH Gonadotropin releasing Hormon giải phóng hormone gonadotropin hCG Human chorionic gonadotropin IFCC International Federation of Hiệp hội Hóa sinh lâm sàng và Clinical Chemistry and Phòng xét nghiệm y học Quốc Laboratory Medecine tế KXĐ Không xác định LC/MS-MS Liquid chromatography- Sắc ký lỏng- khối phổ kép Tandem mass spectrometry LH Luteinizing hormone Hormon kích hoàng thể PD Pregnanediol POR Cytochrome P450 oxidoreductase PT Pregnanetriol PTL Pregnanetriolone QC Quality control Nội kiểm chất lượng RLPTGT Disorders of sex development Rối loạn phát triển giới tính SD Standard deviation Độ lệch chuẩn SIM Selected ion monitoring Ion theo dõi chọn lọc SHBG Sex hormone binding globulin Globulin gắn hormon sinh dục StAR Steroid acute response protein Protein đáp ứng cấp với steroid THA Tetrahydroaldosterone THB Tetrahydrocorticosterone THE Tetrahydrocortisone THF Tetrahydrocortisol THS Tetrahydro 11-deoxycortisol TMSI N-trimethylsilylimidazole TSTTBS Congenital adrenal hyperplasia Tăng sản thượng thận bẩm sinh MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ.1 Chương 1: TỔNG QUAN. Kỹ thuật sắc ký khí - khối phổ.

Nguyên lý chung của kỹ thuật sắc ký. Sắc ký khí – khối phổ. Thẩm định phương pháp và thiết lập khoảng tham chiếu. Thẩm định phương pháp.

Thiết lập khoảng tham chiếu. Sinh tổng hợp hormon steroid và bệnh rối loạn tổng hợp steroid bẩm sinh. Tổng hợp hormon steroid. Bệnh lý rối loạn tổng hợp hormon steroid bẩm sinh.

Ứng dụng kỹ thuật định lượng steroid niệu bằng GC/MS trong chẩn đoán rối loạn tổng hợp hormon steroid bẩm sinh. Một số kỹ thuật khác sử dụng trong chẩn đoán rối loạn tổng hợp hormon steroid. Nghiên cứu về rối loạn tổng hợp hormon steroid bẩm sinh ở Việt Nam.41 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Đối tượng nghiên cứu.

Trang bị, hoá chất và chất liệu nghiên cứu. Trang thiết bị. Hoá chất và vật tư tiêu hao. Chất liệu nghiên cứu.

Phương pháp nghiên cứu. Thẩm định kỹ thuật định lượng steroid niệu bằng GC/MS. Thiết lập khoảng tham chiếu steroid niệu cho trẻ em. Chẩn đoán rối loạn tổng hợp steroid ở trẻ em.

Phân tích và xử lý số liệu. Đạo đức y học.58 Chương 3: KẾT QUẢ. Kết quả thẩm định phương pháp định lượng steroid niệu. Giới hạn định lượng và độ thu hồi.

Độ lặp và độ tái lặp. Kết quả ngoại kiểm steroid niệu. Khoảng tham chiếu các steroid niệu ở trẻ em. Sự phân bố các steroid niệu.

Khoảng tham chiếu nồng độ các steroid niệu. Khoảng tham chiếu tỷ lệ chẩn đoán. Chẩn đoán rối loạn tổng hợp hormon steroid. Đặc điểm nhóm bệnh.

Đặc điểm người bệnh thiếu 21-OH chưa điều trị. Thiếu 11β-OH chưa điều trị. Thiếu 5α-reductase type 2:. Thiếu 3β-HSD II.

Đặc điểm nhóm đã điều trị. Đặc điểm nhóm chưa xác định.103 Chương 4: BÀN LUẬN. Kết quả thẩm định kỹ thuật định lượng steroid niệu bằng GC/MS. Khoảng tham chiếu các sản phẩm steroid niệu ở trẻ em.

Kết quả steroid niệu ở người bệnh rối loạn tổng hợp hormon steroid 117 4. Ứng dụng định lượng steroid trong chẩn đoán ở người bệnh nghi mắc TSTTBS đã điều trị hormon thay thế. Kết quả định lượng steroid niệu ở các trường hợp chưa xác định.134 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số sản phẩm chuyển hóa steroid niệu.1: Các sản phẩm steroid niệu được định lượng.2: Cách thức tiến hành định lượng steroid niệu.3: Một số tỷ lệ chẩn đoán thường dùng.1: Giới hạn định lượng và độ thu hồi của các steroid niệu.2: Độ lặp lại của các steroid niệu.3: Độ tái lặp của các steroid niệu. Mối tương quan kết quả phòng xét nghiệm với ngoại kiểm.

Phân bố độ tuổi và giới tính nhóm chứng. So sánh nồng độ steroid niệu giữa các nhóm tuổi. Khoảng tham chiếu steroid niệu ở trẻ sơ sinh. Khoảng tham chiếu steroid niệu của trẻ 1 tháng - < 2 tuổi.

Khoảng tham chiếu steroid niệu cho trẻ 2 - < 8 tuổi. Khoảng tham chiếu steroid niệu cho trẻ 8-≤11 tuổi. So sánh tỷ lệ chẩn đoán giữa các nhóm tuổi. Khoảng tham chiếu tỷ lệ chẩn đoán cho trẻ sơ sinh.

Khoảng tham chiếu tỷ lệ chẩn đoán cho trẻ 1 tháng-<2 tuổi. Khoảng tham chiếu tỷ lệ chẩn đoán cho trẻ 2-<8 tuổi. Khoảng tham chiếu tỷ lệ chẩn đoán cho trẻ 8-≤11 tuổi. Đặc điểm của nhóm nhóm bệnh.

Phân loại chẩn đoán rối loạn tổng hợp steroid theo tuổi. Đặc điểm nhóm chưa điều trị. So sánh nồng độ steroid niệu nhóm thiếu 21-OH với nhóm chứng. Đặc điểm steroid niệu và tỷ lệ chẩn đoán của nhóm thiếu 21-OH.

Các chỉ số cận lâm sàng của nhóm thiếu 21-OH. Giá trị chẩn đoán thiếu 21-OH của một số thông số. Đặc điểm người bệnh thiếu 11β-OH. Giá trị chẩn đoán thiếu 11β-OH của một số thông số.

Kết quả steroid niệu ở người bệnh thiếu 5α-reductase type 2. Đặc điểm người bệnh thiếu 5α-reductase type 2. Giá trị chẩn đoán thiếu 5α-reductase type 2 của một số tỷ lệ. Kết quả steroid niệu ở người bệnh nghi thiếu 3β-HSD II.

Tỷ lệ chẩn đoán ở người bệnh thiếu 3β-HSD II. Nồng độ các hormon ở người bệnh nghi thiếu 3β-HSD II. Đặc điểm người bệnh thiếu 21-OH đã điều trị. Steroid niệu ở người bệnh thiếu 21-OH đã điều trị.

So sánh steroid niệu ở nhóm thiếu 21-OH đã điều trị. Đặc điểm steroid niệu nhóm chưa xác định.104 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Kết quả ngoại kiểm. Tương quan kết quả An. Tương quan kết quả PT.

Sự tương đồng kết quả Et. Sự tương đồng kết quả DHEA. Sự phân bố nồng độ An ở trẻ nam 8-≤11 tuổi. Nồng độ Cortolone và Cortol theo tuổi.

Nồng độ An, Et, DHEA, 11Keto An theo tuổi. Nồng độ 11OH An, 11OH Et, PD, PT theo tuổi. Nồng độ A’3, THE, THF, 5α-THF theo tuổi. Sắc ký đồ toàn thể của mẫu chuẩn.

Sắc ký đồ người bệnh thiếu 21-OH. Mảnh ion đặc hiệu của 17-OHPN. Mảnh ion đặc hiệu cho PTL. So sánh nồng độ PT giữa các nhóm.

So sánh tỷ lệ PT/(THE + THF +5α-THF) giữa các nhóm. Biểu đồ ROC cho nồng độ PT. Biểu đồ ROC cho tỷ lệ PT/(THE +THF +5α-THF). Sắc ký đồ người bệnh thiếu 11β-OH.

So sánh nồng độ THS giữa các nhóm. So sánh tỷ lệ THS/(THE+THF+5α-THF) giữa các nhóm. Sắc ký đồ toàn thể mẫu thiếu 5α-reductase type 2. Sắc ký đồ mẫu bình thường.

Sắc ký đồ mẫu thiếu 5α-reductase type 2. Tỷ lệ THF/5α-THF ở các nhóm. Sắc ký đồ mẫu thiếu 3β-HSD II. Mảnh ion đặc hiệu cho DHEA.

So sánh nồng độ DHEA giữa các nhóm. So sánh tỷ lệ DHEA/(THE+THF+5α-THF) giữa các nhóm. Thời điểm lấy mẫu của người bệnh thiếu 21-OH.101 DANH MỤC HÌNH Hình 1. Cấu tạo hệ thống sắc ký khí khối phổ.

Sơ đồ sinh tổng hợp các hormon steroid. Hệ thống sắc ký khí – khối phổ Agilent.55 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Rối loạn sinh tổng hợp hormon steroid bẩm sinh là bệnh lý tuyến vỏ thượng thận, giảm tổng hợp một hoặc nhiều hormon vỏ thượng thận do thiếu một phần hoặc hoàn toàn hoạt tính của enzym xúc tác phản ứng tổng hợp hormon steroid.