Luận án TS: Nghiên cứu đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát - Trần Thu Hà, Đại học Y Hà Nội

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI TRẦN THU HÀ Nghiªn cøu x¸c ®Þnh ®ét biÕn gen CYP1B1 g©y bÖnh gl«c«m bÈm sinh nguyªn ph¸t vµ ph¸t hiÖn ngêi lµnh mang gen bÖnh LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI TRẦN THU HÀ Nghiªn cøu x¸c ®Þnh ®ét biÕn gen CYP1B1 g©y bÖnh gl«c«m bÈm sinh nguyªn ph¸t vµ ph¸t hiÖn ngêi lµnh mang gen bÖnh Chuyên ngành: Nhãn khoa Mã số : 62720157 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. Trần Vân Khánh 2. Vũ Thị Bích Thủy HÀ NỘI – 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi là Trần Thu Hà nghiên cứu sinh khoá 33, chuyên ngành nhãn khoa, Trường Đại học Y Hà Nội xin cam đoan: 1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Trần Vân Khánh và PGS.

Vũ Thị Bích Thủy. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam đoan này.

Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Người viết cam đoan Trần Thu Hà CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tiếng Việt BN : Bệnh nhân MP : Mắt phải MT : Mắt trái NR : Đa hình gen mới PCR : Polymerase Chain Reaction SNP : Đa hình gen UD : Đột biến mới chưa xác định Tiếng Anh Bp : Base pair DNA : Deoxyribonucleic acid EDTA : Ethylene Diamin Tetraacetic Acid MLPA : Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification NTP : Nucleoside Triphosphate OCT : Optical Coherence Tomography OD : Optical Density Bảng viết tắt các amino acid MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ.1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN. Đại cương bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát. Lịch sử nghiên cứu bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát. Dịch tễ học bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát.

Cơ chế bệnh sinh của bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát. Chẩn đoán bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát. Điều trị bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát. Đột biến gen CYP1B1 và mối liên quan với lâm sàng.

Đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát. Các kỹ thuật phát hiện đột biến gen CYP1B1. Mối liên quan giữa bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát với đột biến gen. Đột biến CYP1B1 phát hiện ở người lành mang gen bệnh.31 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

Đối tượng nghiên cứu. Tiêu chuẩn lựa chọn. Tiêu chuẩn loại trừ. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.

Phương pháp nghiên cứu. Thiết kế nghiên cứu. Cỡ mẫu và chọn mẫu nghiên cứu. Phương tiện nghiên cứu.

Các bước tiến hành nghiên cứu. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu.47 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. Đặc điểm bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát. Phân bố bệnh nhân theo tuổi phát hiện bệnh.

Phân bố bệnh nhân theo giới. Tiền sử bệnh nhân và gia đình. Tình trạng mắt bị bệnh của bệnh nhân. Phân bố giai đoạn bệnh.

Triệu chứng cơ năng. Dấu hiệu thực thể. Kết quả xác định đột biến gen CYP1B1 và mối liên quan với lâm sàng. Kết quả tách chiết DNA.

Kết quả xác định đột biến gen CYP1B1 bằng kỹ thuật giải trình tự. Kết quả xác định đột biến gen CYP1B1 bằng kỹ thuật MLPA. Tỷ lệ đột biến chung của gen CYP1B1. Mối liên quan giữa lâm sàng và đột biến gen CYP1B1.

Kết quả phát hiện người lành mang gen. Phả hệ có di truyền đột biến. Phả hệ không di truyền đột biến.81 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN. Một số đặc điểm của bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát.

Sự phân bố bệnh nhân theo tuổi phát hiện bệnh. Sự phân bố bệnh nhân theo giới. Tiền sử bệnh nhân và gia đình. Tình trạng mắt bị bệnh của bệnh nhân.

Giai đoạn bệnh của mắt bệnh nhân. Triệu chứng cơ năng. Dấu hiệu thực thể. Kết quả xác định đột biến gen CYP1B1 và mối liên quan với lâm sàng bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát.

Tình trạng đột biến gen CYP1B1. Mối liên quan giữa lâm sàng và đột biến gen CYP1B1. Đột biến gen CYP1B1 trong các thành viên gia đình bệnh nhân. Các phả hệ có di truyền đột biến.

Các phả hệ không di truyền đột biến.118 ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN.120 HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO.121 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Các loại đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát tại các nước khác nhau tính đến năm 2010. Các loại đột biến gen CYP1B1 hay gặp theo vùng lãnh thổ. Phân loại mức độ nặng của bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát.

Lâm sàng và điều trị của bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát trong phả hệ. Tên, kích thước và vị trí của các sản phẩm PCR trong Kit MLPA P128-CYP450 (MRC- Holland). Trình tự mồi dùng cho phản ứng PCR. Tuổi phát hiện bệnh.

Phân bố mắt theo giai đoạn bệnh. Tỷ lệ các triệu chứng cơ năng. Tình trạng giác mạc của nhóm nghiên cứu. Kết quả dự đoán gây bệnh của đột biến điểm mới gen CYP1B1.

Các đa hình SNP của gen CYP1B1 trên bệnh nhân nghiên cứu 57 Bảng 3. Đặc điểm bệnh nhân mang đột biến trên gen CYP1B1. Tỷ lệ các dạng đột biến gen CYP1B1. Mối liên quan giữa thời gian phát hiện bệnh và đột biến gen.

Mối liên quan giữa giới tính và tình trạng đột biến gen. Mối liên quan giữa tiền sử mắc bệnh của mẹ khi mang thai với tình trạng đột biến gen CYP1B1. Mối liên quan giữa tình trạng đột biến gen với số mắt bị bệnh. Mối liên quan giữa giai đoạn bệnh với tình trạng đột biến gen.

Mối liên quan giữa nhãn áp với đột biến gen CYP1B1. Mối liên quan giữa đường kính giác mạc với đột biến gen. Mối liên quan giữa chiều dài trục nhãn cầu với đột biến gen. Mối liên quan giữa mức độ lõm đĩa với đột biến gen CYP1B1.

Mối liên quan giữa số lần phẫu thuật với tình trạng đột biến. Mối liên quan giữa thời gian xuất hiện bệnh với tình trạng đột biến 70 Bảng 3. Mối liên quan giữa thời gian xuất hiện bệnh và số mắt bị bệnh với tình trạng đột biến. Mối liên quan giữa thời gian xuất hiện bệnh, số mắt bị bệnh và giai đoạn bệnh với tình trạng đột biến.

Tỷ lệ phát hiện đột biến gen CYP1B1 di truyền qua các thế hệ 73 Bảng 3. Đột biến gen CYP1B1 của các thành viên gia đình bệnh nhân. Kết quả phát hiện đa hình gen một số gia đình bệnh nhân. Kết quả phát hiện tỷ lệ đột biến ở bệnh nhân châu Á.93 DANH MỤC HÌNH Hình 1.

Phát triển một phần mống mắt trên bề mặt vùng bè. Vị trí của gen MYOC trên nhánh dài nhiễm sắc thể 1. Vị trí của gen LTBP2 trên nhánh dài nhiễm sắc thể 14. Vị trí của gen CYP1B1 trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể 2.

Hình ảnh không gian 3 chiều vùng C' tận của protein CYP1B1. Sơ đồ minh họa cơ chế ảnh hưởng của đột biến gen CYP1B1. Vết rạn giác mạc màng Descemet. Hình ảnh soi góc tiền phòng.

Vị trí đột biến gen CYP1B1 thường gặp. Loại và vị trí đột biến gen CYP1B1 thường gặp ở người châu Á. Loại và vị trí đột biến gen CYP1B1 thường gặp ở người da trắng. Loại và vị trí đột biến gen CYP1B1 thường gặp ở người Di-gan.

Loại và vị trí đột biến gen CYP1B1 gặp ở người Trung Đông. PCR khuếch đại exon 2, gen CYP1B1 đột biến p. Cấu trúc phân tử dNTP và ddNTP. Quá trình tổng hợp DNA bình thường (A)và DNA bị ức chế (B).

Quy trình giải trình tự theo phương pháp ddNTP. Các giai đoạn của Kỹ thuật MLPA (Schouten, 2002). Tỷ lệ phẫu thuật thành công ở nhóm có và không có đột biến. Hình ảnh giải trình tự gen của đột biến p.

Phả hệ gia đình bệnh nhân mang đột biến gen p. Phả hệ gia đình Nhật Bản mang đột biến Asp192Val và Val364Met. Phả hệ 5 gia đình bệnh nhân Việt Nam mang đột biến gen CYP1B1. Phả hệ các gia đình bệnh nhân tại Tây Ban Nha.

Kết quả MLPA sử dụng Kit MLPA P128-CYP450. Sản phẩm PCR exon 2 (A), exon 3 (B) của gen CYP1B1 (+)mẫu đối chứng dương, (-) mẫu đối chứng âm, (1-5) mẫu bệnh nhân, (MK) Marker. Hình ảnh cấu trúc gen CYP1B1 với đột biến p. Hình ảnh đột biến gen của bệnh nhân mã G15.

Hình ảnh đột biến gen của bệnh nhân mã G09. Hình ảnh đột biến gen của bệnh nhân mã G24. Hình ảnh cấu trúc gen CYP1B1 với 04 đột biến mới. Hình ảnh MLPA (hình trái) và kết quả tính toán (Relative Peak Area) bằng phần mềm coffalyser (hình phải) của bệnh nhân G40 và G02.

Hình ảnh MLPA (hình trái) và kết quả tính toán (Relative Peak Area) bằng phần mềm coffalyser (hình phải) của bệnh nhân G45 và G56. Mối liên quan giữa phương pháp phẫu thuật với đột biến gen. Phả hệ gia đình bệnh nhân mã số G40. Hình ảnh đột biến gen của gia đình bệnh nhân mã số G40.

Phả hệ gia đình bệnh nhân mã số G85. Hình ảnh đột biến gen của gia đình bệnh nhân mã số G85. Phả hệ gia đình bệnh nhân mã số G02. Hình ảnh MLPA của các thành viên gia đình bệnh nhân mã số G02.

Các đỉnh tương ứng với vị trí exon 1, exon 3 của gen CYP1B1. Phả hệ gia đình bệnh nhân mã số G56. Phả hệ gia đình bệnh nhân G08. Hình ảnh đột biến p.

Hình ảnh đa hình gen ở gia đình bệnh nhân G08. Phả hệ gia đình bệnh nhân mã số G11. Phả hệ gia đình bệnh nhân mã số G19. Phả hệ gia đình bệnh nhân mã số G20.

Phả hệ gia đình bệnh nhân mã số G21. Phả hệ gia đình bệnh nhân mã số G24.86 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Glôcôm bẩm sinh nguyên phát là tình trạng tăng nhãn áp do sự phát triển bất thường của bán phần trước nhãn cầu. Bệnh thường xảy ra ở hai mắt (65%-80%), phát hiện ở giai đoạn muộn, điều trị gặp tỷ lệ thất bại cao nếu không được điều trị kịp thời và theo dõi chặt chẽ. Đây là một trong những nguyên nhân gây mù lòa quan trọng ở trẻ nhỏ , ,.

Glôcôm bẩm sinh nguyên phát là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường với tần suất mắc bệnh khoảng 1/10. Một số nghiên cứu trước đây đã chỉ ra mối liên quan của bệnh với tình trạng đột biến gen CYP1B1, LTBP2, MYOC, trong đó đột biến gen CYP1B1 chiếm tỷ lệ cao nhất (10%- 100%) , , đột biến gen MYOC và LTBP2 ít gặp hơn (0%-5,5%) , , , , .