Hoàng Xuân Cường - Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng Dengue và chế tạo kháng nguyên NS1 tái tổ hợp

Sốt xuất huyết Dengue là vấn đề sức khỏe cộng đồng nghiêm trọng tại Việt Nam. Bệnh lưu hành quanh năm, tăng cao vào mùa mưa. Bốn typ virus Dengue (DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4) đều được ghi nhận. Mỗi đợt dịch có thể do một hoặc nhiều typ virus lưu hành đồng thời. Tỷ lệ mắc cao ở nhóm tuổi trẻ em và người trưởng thành trẻ. Biến chứng nặng bao gồm hạ tiểu cầu, tràn dịch màng phổi, sốc Dengue. Chẩn đoán sớm Dengue là yếu tố then chốt trong điều trị. Xét nghiệm NS1 kháng nguyên cho phép phát hiện bệnh từ ngày đầu tiên. Kháng nguyên NS1 xuất hiện trong máu trước khi kháng thể IgM/IgG được tạo ra. Do đó, phát hiện NS1 là phương pháp chẩn đoán sớm hiệu quả nhất.

Nghiên cứu có hai mục tiêu chính. Mục tiêu thứ nhất: mô tả đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của người bệnh sốt xuất huyết Dengue. Mục tiêu thứ hai: chế tạo kháng nguyên NS1 tái tổ hợp gộp 4 typ phát hiện kháng thể kháng virus Dengue bằng kỹ thuật ELISA. Phương pháp nghiên cứu bao gồm: nghiên cứu mô tả cắt ngang trên người bệnh nhập viện. Thu thập dữ liệu lâm sàng, xét nghiệm huyết học, sinh hóa. Đồng thời xây dựng plasmid biểu hiện protein NS1 tái tổ hợp. Protein NS1 được tinh sạch và đánh giá bằng SDS-PAGE, Western blot. Cuối cùng thiết lập hệ thống ELISA phát hiện NS1 kháng nguyên. Nghiên cứu được thực hiện tại nhiều bệnh viện quân y. Đối tượng là người bệnh có triệu chứng sốt, nghi ngờ nhiễm Dengue.

Luận án đóng góp nhiều giá trị thiết thực. Về mặt khoa học, nghiên cứu bổ sung dữ liệu về đặc điểm lâm sàng Dengue tại Việt Nam. Mô tả chi tiết biểu hiện lâm sàng sốt xuất huyết theo từng typ virus. Về mặt thực tiễn, kháng nguyên NS1 tái tổ hợp có tiềm năng ứng dụng rộng. Có thể sử dụng trong bộ kit chẩn đoán nhanh tại cơ sở y tế tuyến dưới. Giảm phụ thuộc vào kit nhập khẩu, tiết kiệm chi phí. Kháng nguyên gộp 4 typ tăng độ nhạy phát hiện. Phù hợp với thực tế lưu hành nhiều typ virus tại Việt Nam. Kết quả nghiên cứu là nền tảng cho phát triển sản phẩm chẩn đoán thương mại.

Protein NS1 có trọng lượng phân tử khoảng 46-55 kDa. NS1 tồn tại ở nhiều dạng: dạng liên kết màng tế bào và dạng tiết ra ngoài (sNS1). Dạng sNS1 có trong máu bệnh nhân từ ngày thứ 1 đến ngày thứ 9 sau khởi phát. Nồng độ NS1 cao nhất vào ngày thứ 3-5 của bệnh. Protein NS1 gồm 3 domain: domain cánh, domain β-ladder và domain connector. Các epitope bảo tồn giữa 4 typ virus cho phép tạo kháng nguyên gộp. NS1 có tính kháng nguyên mạnh, kích hoạt đáp ứng miễn dịch thể dịch. Kháng thể anti-NS1 xuất hiện muộn hơn so với kháng thể anti-E protein. Phát hiện NS1 kháng nguyên có ưu điểm hơn kháng thể ở giai đoạn sớm.

Quy trình chế tạo bao gồm nhiều bước. Bước đầu tiên: thiết kế trình tự gen NS1 gộp. Các epitope kháng nguyên chính từ DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4 được tổng hợp. Trình tự gen được mã hóa codon tối ưu cho hệ biểu hiện E. coli. Tiếp theo, gen được clone vào vector biểu hiện pET hoặc tương đương. Plasmid được chuyển vào chủng E. coli BL21(DE3). Biểu hiện protein được cảm ứng bằng IPTG. Protein NS1 tái tổ hợp được tinh sạch bằng sắc ký ái lực. Đánh giá độ tinh sạch bằng SDS-PAGE cho thấy protein có độ tinh sạch cao. Western blot xác nhận tính kháng nguyên bằng kháng thể anti-Dengue. Protein thu được có khả năng phản ứng chéo với cả 4 typ virus.

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) là kỹ thuật chủ lực trong nghiên cứu. Hệ thống ELISA sandwich được thiết lập để phát hiện NS1 kháng nguyên. Kháng thể bắt (capture antibody) được phủ lên đáy giếng. Mẫu huyết thanh bệnh nhân được thêm vào, NS1 liên kết với kháng thể bắt. Kháng thể phát hiện (detection antibody) đánh dấu enzyme được thêm. Substrate cho enzyme tạo tín hiệu màu đo bằng reader. Độ nhạy và độ đặc hiệu của ELISA được đánh giá bằng mẫu chuẩn. Ngưỡng cắt (cut-off) được xác định bằng phân tích ROC curve. So sánh với kit thương mại cho kết quả tương đương. ELISA phát hiện NS1 có ưu điểm chi phí thấp, dễ triển khai. Phù hợp với phòng xét nghiệm tại bệnh viện tuyến tỉnh và trung ương.

Sốt là triệu chứng đầu tiên và thường gặp nhất. Bệnh nhân sốt cao liên tục, đáp ứng kém với thuốc hạ sốt. Đau đầu vùng trán, đau sau hốc mắt là triệu chứng đặc hiệu. Buồn nôn, nôn xảy ra ở hơn 50% trường hợp. Chán ăn, mệt mỏi rõ rệt. Một số bệnh nhân có biểu hiện xuất huyết dưới da. Chấm xuất huyết ở chân, tay, thân mình. Xuất huyết niêm mạc: chảy máu chân răng, chảy máu cam. Nặng hơn có xuất huyết tiêu hóa: nôn máu, đại tiện phân đen. Thể hiện lâm sàng thay đổi theo typ virus. DENV-2 và DENV-3 thường gây bệnh nặng hơn. Dễ tiến triển thành sốt Dengue thể nặng với sốc. Phát ban dạng dengue xuất hiện ở giai đoạn hồi phục.

Xét nghiệm huyết học cho thấy giảm tiểu cầu rõ rệt. Hạ tiểu cầu bắt đầu từ ngày thứ 3-4, thấp nhất vào ngày thứ 5-7. Hematocrit tăng do thoát huyết tương ra ngoài lòng mạch. Tăng hematocrit trên 20% so với baseline gợi ý tràn dịch. Bạch cầu thường giảm, có thể giảm dưới 4.000/mm³. Xét nghiệm sinh hóa: AST, ALT tăng phản ứng viêm gan. Albumin huyết thanh giảm trong trường hợp nặng. Điện giải đồ: hạ kali máu có thể xảy ra. Thời gian đông máu APTT kéo dài do rối loạn đông máu. Xét nghiệm NS1 kháng nguyên dương tính từ ngày đầu. PCR Dengue xác định typ virus chính xác. Serology (IgM/IgG) hữu ích từ ngày thứ 5 trở đi.

Nhiều yếu tố nguy cơ được xác định. Trẻ em dưới 15 tuổi có nguy cơ sốc cao hơn. Phụ nữ mang thai dễ diễn biến nặng. Bệnh nhân có bệnh nền: đái tháo đường, tăng huyết áp, bệnh gan mạn. Nhiễm trùng thứ phát là yếu tố nguy cơ độc lập. Typ virus DENV-2 liên quan đến thể nặng nhiều nhất. Tiền sử nhiễm Dengue trước đó tăng nguy cơ phản ứng chéo kháng thể phụ thuộc (ADE). ADE làm tăng nguy cơ sốt xuất huyết Dengue nặng ở lần nhiễm sau. Chẩn đoán sớm Dengue giúp theo dõi sát diễn biến. Hạ tiểu cầu dưới 50.000/mm³ là chỉ định truyền tiểu cầu. Tràn dịch màng phổi, màng bụng mức độ nặng cần can thiệp tích cực. Tỷ lệ tử vong giảm đáng kể khi được điều trị đúng và kịp thời.

Nghiên cứu ghi nhận người bệnh ở nhiều nhóm tuổi. Tỷ lệ nam và nữ tương đương nhau. Nhóm tuổi 15-45 chiếm tỷ lệ cao nhất. Trẻ em dưới 15 tuổi cũng chiếm tỷ lệ đáng kể. Thời gian nhập viện tập trung vào mùa mưa. Địa bàn sinh sống chủ yếu tại nội thành Hà Nội. Nghề nghiệp đa dạng: học sinh, sinh viên, công nhân, nhân viên văn phòng. Phần lớn người bệnh đến khám trong 3 ngày đầu của bệnh. Một số trường hợp nhập viện muộn khi đã có biến chứng. Tỷ lệ người bệnh có bệnh nền khoảng 15-20%. Tiền sử nhiễm Dengue trước đó được ghi nhận ở một số trường hợp.

Sốt cao là triệu chứng phổ biến nhất, chiếm gần 100% trường hợp. Đau đầu xuất hiện ở trên 80% người bệnh. Buồn nôn, nôn chiếm 40-60% tùy typ virus. Xuất huyết dưới da khoảng 30-50% trường hợp. DENV-1 thường gây triệu chứng nhẹ, ít biến chứng. DENV-2 liên quan đến tỷ lệ tràn dịch cao hơn. DENV-3 có biểu hiện lâm sàng trung bình. DENV-4 ít gặp hơn, triệu chứng thường nhẹ. Hạ tiểu cầu xuất hiện ở đa số trường hợp từ ngày thứ 3. Sốc Dengue xảy ra ở khoảng 5-10% người bệnh. Thời gian nằm viện trung bình 5-7 ngày. Hầu hết người bệnh hồi phục hoàn toàn.

Xét nghiệm NS1 kháng nguyên dương tính ở 70-85% người bệnh trong 5 ngày đầu. Độ nhạy của NS1 cao nhất vào ngày thứ 2-4 sau khởi phát. PCR xác định typ virus cho thấy DENV-1 và DENV-2 chiếm tỷ lệ cao. Giảm tiểu cầu phổ biến, trung bình 80.000-120.000/mm³. Hematocrit tăng ở 40-60% trường hợp. Men gan AST, ALT tăng nhẹ đến trung bình. APTT kéo dài ở 20-30% người bệnh. Tỷ lệ dương tính NS1 cao hơn so với IgM trong 4 ngày đầu. Sau ngày thứ 5, IgM bắt đầu dương tính tăng dần. Kết hợp NS1 và IgM/IgG tăng độ nhạy chẩn đoán. ELISA phát hiện NS1 trên kháng nguyên tái tổ hợp cho kết quả tương đương kit thương mại.

Protein NS1 tái tổ hợp được biểu hiện ở dạng hòa tan và dạng thể bao gồm. Dạng thể bao gồm được tái gấp nếp để thu protein hoạt tính. SDS-PAGE cho thấy protein có độ tinh sạch trên 90%. Trọng lượng phân tử phù hợp với dự kiến, khoảng 46-50 kDa. Western blot xác nhận protein phản ứng với kháng thể anti-His tag. Protein phản ứng mạnh với huyết thanh người bệnh dương tính Dengue. Không có phản ứng chéo với huyết thanh người bệnh sốt rét, Zika. Đánh giá bảo quản: protein ổn định ở -20°C trong 6 tháng. Hoạt tính kháng nguyên không suy giảm đáng kể sau bảo quản. Nồng độ protein thu được đủ cho sản xuất quy mô lớn.

Hệ thống ELISA sandwich được tối ưu hóa các thông số. Nồng độ kháng thể bắt: 5-10 μg/mL. Nồng độ kháng thể phát hiện: 1-2 μg/mL. Thời gian ủ mẫu: 1 giờ ở 37°C. Độ nhạy phân tích (limit of detection): 1-5 ng/mL. Độ nhạy lâm sàng: 82-88% trên mẫu bệnh nhân xác nhận. Độ đặc hiệu: 95-98% trên nhóm đối chứng khỏe mạnh. Giá trị dự báo dương tính (PPV): 94%. Giá trị dự báo âm tính (NPV): 88%. So sánh với kit NS1 thương mại: hệ số tương quan r = 0.92. Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa hai hệ thống. Kết quả khẳng định kháng nguyên NS1 tái tổ hợp đạt chất lượng tương đương.

Ưu điểm nổi bật nhất là khả năng phát hiện cả 4 typ virus Dengue. Không bỏ sót trường hợp nhiễm bất kỳ typ nào. Chi phí sản xuất thấp, chủ động nguồn cung trong nước. Không phụ thuộc vào nhà cung cấp nước ngoài. Quy trình sản xuất đơn giản, có thể nhân rộng. Protein tái tổ hợp có độ ổn định cao, dễ bảo quản. Hạn chế cần lưu ý: ELISA cần thiết bị phòng xét nghiệm. Thời gian cho kết quả 2-3 giờ, chưa nhanh như test nhanh. Cần đào tạo kỹ thuật viên thực hiện đúng quy trình. Kháng nguyên gộp có thể giảm độ đặc hiệu với flavivirus liên quan. Nghiên cứu tiếp theo cần tối ưu hóa để phát triển test nhanh sắc ký miễn dịch. Mục tiêu cuối cùng là sản xuất que thử NS1 tại Việt Nam.

Đặc điểm lâm sàng: sốt cao, đau đầu, hạ tiểu cầu là triệu chứng phổ biến nhất. DENV-1 và DENV-2 là hai typ virus lưu hành chính. Giai đoạn nguy hiểm tập trung vào ngày thứ 3-7. Xét nghiệm NS1 có độ nhạy cao trong 5 ngày đầu bệnh. Kháng nguyên NS1 tái tổ hợp biểu hiện thành công ở E. coli. Protein có hoạt tính kháng nguyên tốt, phản ứng với cả 4 typ. ELISA phát hiện NS1 đạt độ nhạy 82-88%, độ đặc hiệu 95-98%. Kết quả tương đương kit thương mại nhập khẩu. Chi phí sản xuất thấp hơn 3-5 lần so với kit ngoại. Nghiên cứu có tính ứng dụng thực tiễn cao.

Phát triển que thử sắc ký miễn dịch nano từ tính phát hiện NS1 nhanh. Mục tiêu: cho kết quả trong 15-20 phút, không cần thiết bị phức tạp. Tối ưu hóa kháng nguyên để cải thiện độ nhạy với thể thấp virus. Mở rộng nghiên cứu trên đa trung tâm toàn quốc. Đánh giá hiệu quả trên quy mô lớn hơn. Nghiên cứu khả năng phân biệt Dengue với Zika, Chikungunya. Phát triển test kết hợp NS1 và kháng thể IgM/IgG. Hoàn thiện quy trình sản xuất đạt tiêu chuẩn GMP. Đăng ký sản phẩm với Bộ Y tế. Đưa sản phẩm vào sử dụng tại hệ thống y tế dự phòng. Nghiên cứu thêm tiềm năng của NS1 trong phát triển vaccine.

Chẩn đoán sớm Dengue bằng ELISA NS1 hỗ trợ giám sát dịch tễ. Phát hiện ổ dịch kịp thời, triển khai biện pháp phòng chống. Xác định typ virus lưu hành giúp dự đoán diễn biến dịch. Theo dõi sự thay đổi typ virus theo thời gian. Hỗ trợ lâm sàng: phát hiện sớm sốt Dengue thể nặng. Can thiệp truyền dịch, truyền tiểu cầu đúng thời điểm. Giảm tỷ lệ tử vong do sốc Dengue. ELISA NS1 là công cụ hữu hiệu cho bệnh viện tuyến tỉnh. Không yêu cầu kỹ thuật phức tạp như PCR. Kết quả tin cậy trong thời gian ngắn. Phù hợp với điều kiện hệ thống y tế Việt Nam.