Nghiên cứu thu nhận nattokinase tái tổ hợp trên hệ thống bacillus subtilis

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN QUỐC TUẤN NGHIÊN CỨU THU NHẬN NATTOKINASE TÁI TỔ HỢP TRÊN HỆ THỐNG Bacillus subtilis LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Tp. Hồ Chí Minh – Năm 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN QUỐC TUẤN NGHIÊN CỨU THU NHẬN NATTOKINASE TÁI TỔ HỢP TRÊN HỆ THỐNG Bacillus subtilis Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số chuyên ngành: 62 42 30 15 Phản biện 1: PGS.

Đỗ Thị Hồng Tươi Phản biện 2: TS. Lê Thái Hoàng Phản biện 3: TS. Nguyễn Thị Bạch Huệ Phản biện độc lập 1: TS. Lê Thái Hoàng Phản biện độc lập 2: TS.

Nguyễn Thị Bạch Huệ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. Lê Thị Thuý Ái Tp. Hồ Chí Minh – Năm 2019 LỜI CẢM ƠN Để có được như ngày hôm nay, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được biết bao sự chỉ bảo, dạy dỗ, sự giúp đỡ quan tâm và lời động viên của tất cả mọi người. Tôi xin chân thành cảm ơn đặc biệt đến: Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS.

Trần Cát Đông và TS. Lê Thị Thúy Ái đã tận tình hướng dẫn và định hướng nghiên cứu và sửa chữa để tôi có thể hoàn thành luận án. Xin gửi lời tri ân đến Quý thầy cô thuộc Bộ môn Sinh Hóa: PGS. Phạm Thị Ánh Hồng, PGS.

Đồng Thị Thanh Thu, Cô Lâm Thị Kim Châu, Cô Nguyễn Thị Huyên, Thầy Trần Mỹ Quan và Thầy Văn Đức Chín đã dạy dỗ, đặt nền tảng kiến thức vững chắc trong sinh hóa. Thầy Cô còn là tấm gương sáng cho con trong con đường nghiên cứu và giảng dạy. Đặc Biệt con xin gửi lời cảm ơn đến cô PGS. Phạm Thị Ánh Hồng, cô đã bỏ nhiều công sức để sửa chữa và có những góp ý rất quý báu giúp con có thể hoàn thành luận án này.

Không chỉ cho con kiến thức Cô còn cho con có cơ hội góp phần xây dựng Bộ môn Sinh hóa ngày càng phát triển. Con sẽ mãi nhớ ơn Cô… Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý anh chị em đồng nghiệp trong Bộ môn Sinh hóa đã luôn quan tâm giúp đỡ tôi rất nhiều trong nghiên cứu và công tác, đặc biệt PGS. Ngô Đại Nghiệp và người anh cả TS. Đinh Minh Hiệp, chị TS.

Lương Bảo Uyên. Không thể không kể đến các bạn học viên cao học, sinh viên đã cùng tôi nghiên cứu và các bạn đã giúp đỡ tôi rất nhiều cả trong nghiên cứu và công việc. Xin cảm ơn các bạn : Thu Kiều, Kim Anh, Nương, Thúy, Lĩnh, Thư, Hà, Khương, An, Chí, Duyên, Sương… Em cũng xin chân thành cảm ơn các anh chị và các bạn cùng khóa đã luôn quan tâm, động viên Cuối cùng trong tình thương gia đình, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ông Bà nội, Ba mẹ đã sinh thành dưỡng dục. Đặc biệt anh muốn cảm ơn đến Em và Con, hai người và gia đình là nơi anh tìm được sự an bình trong cuộc sống và là nguồn động viên để anh hoàn thành tốt luận án này.

Xin mọi người nhận ở nơi con lòng biết ơn chân thành và lời chào trân trọng, lời kính chúc sứa khỏe và an lành trong cuộc sống. Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 04 tháng 06 năm 2019 Trần Quốc Tuấn Trang Bảng 1.1 Tính chất của nattokinase .1 Các trình tự mồi để khuếch đại và giải trình tự gen mã hóa nattokinase .2 Thành phần phản ứng PCR .1 Quan sát đại thể và khả năng phân giải fibrin .2 Kích thước dự kiến của plasmid tái tổ hợp pDG1730 PSgrac-aprN .3 So sánh hoạt tính nattokinase trong dịch ngoại bào của các chủng Bacillus .4 Khoảng giá trị khảo sát của các thông số tối ưu .5 Thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman .6 Mức ảnh hưởng và giá trị p-value của từng biến độc lập trong thiết kế Plackett-Burman .7 Kết quả phân tích ANOVA của mô hình hồi quy theo Plackett- Burman .8 Thiết kế thí nghiệm leo dốc theo phương pháp Box-Wilson .9 Kết quả thực nghiệm leo dốc theo phương pháp Box-Wilson .10 Giá trị các yếu tố sau khi thực hiện thí nghiệm leo dốc Box- Wilson .11 Thiết kế và kết quả thí nghiệm Box-Behnken .12 Kết quả phân tích ANOVA của các yếu tố hồi quy theo Box- Behnken .13 Kết quả phân tích ANOVA của mô hình hồi quy theo phương pháp Box-Behnken .14 So sánh kết quả thực nghiệm và dự đoán hoạt tính nattokinase trong môi trường tối ưu .15 So sánh hoạt tính nattokinase khi nuôi vi khuẩn trong môi trường trước và sau khi tối ưu .16 Thu nhận nattokinase bằng phương pháp lọc màng .17 Thu nhận nattokinase bằng các phương pháp tủa .18 Kết quả tủa phân đoạn muối ammonium sulfate .19 Kết quả sắc ký trao đổi anion Q-sepharose .20 Kết quả lọc gel sephadex G-75 của ba phân đoạn 11, 12, 13 .21 Tổng kết các bước tinh sạch bằng kỹ thuật sắc ký. Ảnh hưởng của các chất ức chế và ion kim loại lên hoạt tính nattokinase .23 Ảnh hưởng của các chất mang lên hoạt tính nattokinase. 132 ii Trang Hình 1.1 Sản phẩm natto.

Mô hình định vị của Ser221 tại vị trí xúc tác của nattokinase. Cấu trúc không gian (3D) và vị trí hoạt động của nattokinase. Sơ đồ cấu trúc chuỗi prepropeptide của nattokinase. Sự phân giải huyết khối trong kiểm soát hiện tượng tiêu sợi huyết.

Cơ chế hoạt động của nattokinase thủy phân fibrin. Quy trình sản xuất NSK-SD sử dụng chủng B. Hoạt tính thủy phân huyết khối của nattokinase trên mô hình thử nghiệm huyết khối in vivo. Con đường tiết Sec (Sec pathway) .10 Sơ đồ vector biểu hiện pBG01 và cấu trúc của Promoter PSgrac .11 Sơ đồ vector biểu hiện pDG1730.

Sản phẩm natto dùng phân lập. Sơ đồ vector pBluescript II KS (+). Thang chuẩn DNA 1kb và protein. Sơ đồ các bước phân lập, sàng lọc chủng Bacillus sp từ các sản phẩm natto và tạo dòng gen aprN vào hệ thống pB nhằm lưu trữ gen và giải trình tự .2 Các dạng khuẩn lạc Bacillus spp.

phân lập từ các sản phẩm natto. Định tính khả năng thủy phân huyết khối in-vitro từ dịch chiết sau lên men chủng Bacillus sp.4 Thử nghiệm hoạt tính thủy phân fibrin ở các chủng phân lập sau 3giờ ủ .5 Sản phẩm khuếch đại gen aprN từ DNA bộ gen các chủng Bacillus spp. phân lập từ natto và trên gel agarose 1% .6 Kết quả sàng lọc dòng tế bào E. coli DH5α có mang pB-aprN bằng phản ứng PCR .7 Kết quả sàng lọc 12 dòng tế bào E.

coli DH5α có mang pB-aprN bằng phản ứng PCR và bản mẫu là các plasmid .8 Kết quả đại diện phân tích dòng tế bào E. coli có mang pB-aprN bằng BamHI .9 Trình tự 275 amino acid ở nattokinase. So sánh một phần trình tự gen aprN của chủng D2 trường hợp sai khác một nucleotide so với trình tự chuẩn .11: Trình tự codon mã hóa gen aprN khuyết cytosine tại vị trí 437 .12 Trình tự gen aprN của chủng B2 khác biệt 10 nucleotide so với aprN chuẩn công bố .13 Một phần trình tự mã hóa gen aprE của chủng B2 được so sánh với nattokinase cho thấy khác biệt ở vi trí quan trọng Valine 298. Sơ đồ các bước tạo dòng gen aprN vào hệ thống pBG01 trong Bacillus subtilis DB104 .15 Kết quả kiểm tra sự dòng hóa aprN bằng PCR khuẩn lạc, cặp mồi aprN-F-BamHI/pMTL-R .16 Plasmid tái tổ hợp pBG01-aprN cắt với HindIII .17 Kết quả sàng lọc chủng Bacillus subtilis khả nạp trên đĩa môi trường có bổ sung kháng sinh chloramphenicol.18 Kết quả kiểm tra sự dòng hóa aprN bằng PCR khuẩn lạc với cặp mồi aprN-F/pMTL-R .19 Kết quả kiểm tra sự dòng hóa aprN bằng PCR với bản mẫu là các plasmid tái tổ hợp, cặp mồi aprN-F/pMTL-R.

Phân tích nattokinase tái tổ hợp môi trường nuôi cấy bằng điện di SDS-PAGE. Phân tích nattokinase tái tổ hợp nội bào bằng điện di SDS-PAGE .22 Sơ đồ các bước tạo dòng casset biểu hiện gen PSgrac-aprN vào plasmid pDG1730 trong Bacillus subtilis DB104 .23 Cắt kiểm tra pDG1730 và pBG01-aprN bằng EcoRI .24 Sàng lọc và kiểm tra plasmid tái tổ hợp pDG1730 PSgrac-aprN .25 Sàng lọc dòng tế bào Bacillus subtilis mang casset biểu hiện gen aprN tại locus amyE .26 Kiểm tra dòng Bacillus subtilis amyE::Pgrac-aprN bằng PCR sử dụng DNA bộ gen làm bản mẫu khuếch đại .27 So sánh khả năng tiết nattokinase trong dịch ngoại bào của các chủng Bacillus bằng điện di SDS-PAGE .28 Ảnh hưởng thành phần khoáng đến hoạt tính nattokinase .29 Ảnh hưởng của nồng độ K2HPO4 đến hoạt tính nattokinase .30 Ảnh hưởng của nồng độ CaCl2 đến hoạt tính nattokinase .31 Ảnh hưởng của nồng độ MgSO4 đến hoạt tính nattokinase .32 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hoạt tính nattokinase .33 Ảnh hưởng của nguồn carbon đến hoạt tính nattokinase .34 Ảnh hưởng của nồng độ glucose đến hoạt tính nattokinase .35 Ảnh hưởng của các nguồn nitơ đến hoạt tính nattokinase .36 Ảnh hưởng nồng độ cao nấm men đến hoạt tính nattokinase .37 Mật độ tế bào ban đầu khi cảm ứng IPTG ảnh hưởng đến hoạt tính nattokinase .38 Ảnh hưởng của nồng độ IPTG đến hoạt tính nattokinase .39 Ảnh hưởng của thời gian thu mẫu đến hoạt tính nattokinase .40 Ảnh hưởng của pH môi trường đến hoạt tính nattokinase .41 Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến hoạt tính nattokinase .42 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính nattokinase .44a, b: Mặt đáp ứng hoạt tính nattokinase theo cao nấm men – glucose và cao nấm men – NaCl .44c, d: Mặt đáp ứng hoạt tính nattokinase theo cao nấm men – pH và glucose và NaCl .44e, f: Mặt đáp ứng hoạt tính nattokinase theo glucose – pH và NaCl – pH .45 Theo dõi oxy hòa tan khi cố định tốc độ khuấy đảo trong suốt quá trình lên men .46 Ảnh hưởng của tốc độ khuấy đảo lên hoạt tính nattokinase của dịch nuôi cấy.47 Ảnh hưởng của tốc độ thông khí lên hoạt tính nattokinase .48 Thời gian thu nhận enzyme tại quy mô lên men 3 lít .49 Kết quả điện di SDS- PAGE dịch ngoại bào trong lên men bioreactor 3 lít.50 Kết quả phân tích điện di của nattokinase thu nhận bằng phương pháp lọc màng .51 Kết quả phân tích điện di của các phân đoạn được tủa bằng ammonium sulphate bão hoà từ 40 – 90% .52 Phân tích điện di protein thu nhận từ tinh chế sắc ký kỵ nước dịch tủa không qua bước thẩm tách .53 Kết quả phân tích điện di các phân đoạn thu nhận từ quá trình tinh sạch sắc ký trao đổi cation .54 Đồ thị biểu diễn hoạt tính nattokinase và hàm lượng protein của từng phân đoạn thu được qua sắc ký trao đổi anion Q-sepharose .55 Kết quả phân tích điện di SDS-PAGE các phân đoạn sau sắc ký trao đổi anion Q-sepharose .