Nghiên cứu tạo mini-cellulosome từ protein Clostridium biểu hiện trên Bacillus subtilis

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN HOÀNG NGỌC PHƯƠNG NGHIÊN CỨU TẠO MINI-CELLULOSOME TỪ CÁC PROTEIN TÁI TỔ HỢP CỦA CLOSTRIDIUM ĐƯỢC BIỂU HIỆN BẰNG HỆ THỐNG BACILLUS SUBTILIS LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC TP. Hồ Chí Minh – Năm 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN HOÀNG NGỌC PHƯƠNG NGHIÊN CỨU TẠO MINI-CELLULOSOME TỪ CÁC PROTEIN TÁI TỔ HỢP CỦA CLOSTRIDIUM ĐƯỢC BIỂU HIỆN BẰNG HỆ THỐNG BACILLUS SUBTILIS Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã số chuyên ngành: 62 42 40 01 Phản biện 1: PGS.

Nguyễn Thúy Hương Phản biện 2: PGS. Lê Hùng Anh Phản biện 3: TS. Đoàn Thị Ngọc Thanh Phản biện độc lập 1: TS. Đoàn Thị Ngọc Thanh Phản biện độc lập 2: TS.

Nguyễn Hoàng Dũng NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. Trần Linh Thước 2. Phan Thị Phượng Trang TP. Hồ Chí Minh – Năm 2019 LỜI CẢM ƠN Con xin cảm ơn các thành viên trong gia đình luôn là mái ấm và điểm tựa vững chắc của con.

Em xin chân thành cảm ơn thầy Trần Linh Thước, cô Phan Thị Phượng Trang, thầy Nguyễn Đức Hoàng đã tận tâm hướng dẫn phương pháp nghiên cứu khoa học, tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành luận án. Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của thầy Joseph A. Loo, cô Rachel Loo, cô Nguyễn Thị Hồng Hạnh tại Đại học California - Los Angeles, USA (UCLA) và các thầy cô của tổ chức Center for Global Mentoring, UCLA. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật và Chuyển hóa Sinh học đã hỗ trợ, tạo điều kiện để em hoàn thành luận án.

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, anh chị, các NCS, học viên, sinh viên của Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học, PTN Công nghệ Sinh học Phân tử và Môi trường, Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật & Chuyển hóa Sinh học, Bộ môn Vi sinh, Bộ môn Sinh hóa, Bộ môn Di truyền, Phòng Sau Đại học, Văn phòng Khoa Sinh & CNSH đã tạo điều kiện, giúp đỡ em hoàn thành luận án. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án tiến sĩ “Nghiên cứu tạo mini-cellulosome từ các protein tái tổ hợp của Clostridium được biểu hiện bằng hệ thống Bacillus subtilis” là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu và kết quả trong luận án là trung thực và không vi phạm bản quyền của tác giả (nhóm tác giả) nghiên cứu khác. Các tham khảo và kế thừa đều được trích dẫn và tham chiếu đầy đủ.

Nguyễn Hoàng Ngọc Phương Mục lục MỤC LỤC MỤC LỤC. i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT .iv DANH MỤC CÁC BẢNG. vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ .vii MỞ ĐẦU. 1 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .1 Các vi sinh vật sản xuất cellulase .2 Phân loại cellulase .3 Phương pháp kiểm tra và đánh giá hoạt tính cellulase .1 Đặc điểm cấu tạo cellulosome của C.2 Ứng dụng của cellulosome .3 Tương tác cohesin – dockerin .4 Cellulase phức hệ được nghiên cứu trong Luận án .4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .5 Bacillus subtilis và tiềm năng biểu hiện protein tái tổ hợp .1 Đặc điểm phân loại và hình thái .2 Tiềm năng sản xuất protein tái tổ hợp .6 Các phương pháp kiểm tra biểu hiện protein tái tổ hợp .26 2 VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP .1 Dụng cụ và thiết bị.1 Chủng vi sinh vật .2 Môi trường nuôi cấy .3 Phương pháp nghiên cứu .1 Thiết kế các protein tái tổ hợp .2 Tạo dòng các plasmid .3 Biến nạp plasmid mục tiêu vào B.4 Kiểm tra sự sáp nhập của mini-CipA vào bộ gen B.5 Phát hiện protein tiết trong dịch protein ngoại bào B.6 Phân tích tương tác cohesin - dockerin bằng ELISA.7 Phân tích tương tác của CBM với cơ chất RAC (Pull down assay) .8 Định lượng hoạt tính endoglucanase bằng phương pháp DNS 96 giếng .9 Hiệu quả phối hợp thủy phân CMC của phức hệ mini-cellulosome .10 Phương pháp thống kê đánh giá và phân tích kết quả.

60 3 KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN.1 Tạo dòng và biểu hiện các đơn vị xúc tác .1 Tạo dòng plasmid mã hóa cho Cel8A/pHT1454 và cCel5CCA/pHT175761 3.2 Phân tích hoạt tính endoglucanase trên môi trường thạch .3 Phân tích biểu hiện Cel8A và cCel5CCA trong dịch ngoại bào bằng SDS- PAGE và Western Blot .4 Khảo sát nồng độ IPTG và thời gian cảm ứng đến quá trình tiết của Cel8A và cCel5CCA .2 Tạo dòng và biểu hiện protein scaffoldin mini-CipA.1 Tạo dòng plasmid pHT1701 .2 Kiểm tra sự sáp nhập mini-CipA vào bộ gen B.3 Phân tích mini-CipA dạng tiết trong dịch nuôi cấy B. subtilis WB800N mang plasmid pHT1701. 73 ii Mục lục 3.4 Phân tích LC-MS/MS biểu hiện của mini-CipA trong dịch ngoại bào của B. subtilis WB800N mang plasmid pHT1701 .3 Phân tích các tương tác trong mini-cellulosome .1 Phân tích tương tác cohesin-dockerin bằng ELISA.2 Tương tác của CBM với cơ chất RAC.4 Hiệu quả phối hợp thủy phân CMC của phức hệ mini-cellulosome .1 Hoạt tính CMCase của cellulase khi có hỗ trợ của mini-CipA .2 Tỉ lệ S thể hiện ảnh hưởng của hiệu ứng phối hợp gây ra do mini-CipA.

88 4 KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ .91 DANH MỤC CÔNG TRÌNH. 93 TÀI LIỆU THAM KHẢO. a iii Danh mục chữ viết tắt DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT aa amino acid Anova Analysis of variance Amp Ampicillin AmyQ α-amylase, enzyme thủy phân tinh bột bla -lactamase, enzyme phân hủy một số kháng sinh như ampicillin BCA 2,2′-bicinchoninate, hợp chất dùng trong định lượng đường khử BSA Bovine Serum Albumin, protein albumin từ bò bp base pair, đơn vị đo chiều dài gen hoặc DNA cat Chloramphenicol acetyltransferase, gen kháng Chloramphenicol CBM Cellulose Binding Module, cấu trúc protein bậc 3 giúp bám lên cellulose cCel5CCA Cel5CCA thể khảm CMC Carboxymethyl cellulose Cm Chloramphenicol CID Collision-induced dissociation (phân ly do va chạm) Da Dalton, đơn vị khối lượng nguyên tử DNA Deoxyribose Nucleic Acid DNS Dinitro salicylic acid DP Degree of polymerization DTT Dithiothreitol ESI Electronspray ionization FPA Filter Paper Assay FPU Filter Paper Unit – Đơn vị hoạt tính của phương pháp FPA GC Gas Chromatography - Sắc kí khí GFP Green Fluorescent Protein, protein phát huỳnh quang GH Họ Glycoside Hydrolase phân loại bởi www.org His Histidine HPLC High-performance liquid chromatography HRP Horse-radish peroxidase IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside iv Danh mục chữ viết tắt IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry Kd Hằng số phân ly phản ánh ái lực của tương tác giữa hai phần tử kDa kilo Dalton LB Môi trường Luria - Bertani LB-Amp Môi trường Luria - Bertani chứa Ampicillin 100 ug/ml LB-Cm Môi trường Luria - Bertani chứa Chloramphenicol 10 ug/ml LC Liquid chromatography, sắc ký lỏng hiệu năng cao LC-MS/MS Sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép hai lần khối phổ MS/MS Tandem mass spectrometry, hai lần khối phổ NCBI National Center for Biotechnology Information, USA neo Gen kháng neomycine PCR Polymerase Chain Reaction, phản ứng chuỗi polymerase PBS Phosphate Buffer Saline, dung dịch đệm phosphat PBST Phosphate Buffer Saline bổ sung Tween 1% OD Optical Density, mật độ quang RAC Regenerated Amorphous Cellulose, cellulose vô định hình tân tạo RS Reducing Sugar, đường khử tương đương SSamyQ Vùng tín hiệu tiết của protein -amylase SDS Sodium Dodecyl Sulphate SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide gel electrophoresis Strep Strep-tactin, đuôi dung hợp để tinh chế hoặc phát hiện bằng kháng thể TEMED N, N, N’, N’- Tetramethylenediamine TMB 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine v Danh mục bảng DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Đặc điểm cấu trúc và hoạt tính cellulase của các họ GH [112] .2 Các loài vi sinh vật tạo cellulosome [34] .3 Một số nhóm nghiên cứu biểu hiện mini-cellulosome tái tổ hợp .1 Các mồi sử dụng trong luận án .2 Thông tin các plasmid được thiết kế trong luận án .3 Thành phần phản ứng PCR thu gen .4 Thành phần phản ứng cắt với enzyme cắt giới hạn .5 Thành phần phản ứng nối với T4 DNA ligase .6 Thành phần phản ứng In-Fusion .7 Thành phần phản ứng PCR khuẩn lạc .8 Các cặp mồi dùng trong PCR khuẩn lạc kiểm tra gen sáp nhập.9 Các bước trong quy trình định lượng đường khử DNS 96 giếng .10 Các điều kiện nuôi cấy được dùng khảo sát hiệu quả phối hợp .11 Thành phần protein ngoại bào theo các nghiệm thức .1 Các peptide phát hiện thuộc protein mini-CipA/pHT1701 .2 Phổ MS/MS lý thuyết của peptide VTNTGSSAIDLSK .3 Các peptide phát hiện thuộc protein dung hợp Cel8A-CBM/pHT1733 .81 vi Danh mục hình DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Các bậc tổ chức của sợi cellulose [113] .2 Các nhóm cellulase tham gia thủy phân cellulose .3 Các cơ chất sử dụng cho từng loại cellulase và phương pháp định lượng [111] .4 Cấu tạo cellulosome của C.5 Cấu trúc cohesin (phiến ) và dockerin (xoắn ) và các aa bảo tồn [92] .6 Con đường tiết Sec (Sec pathway) [72].7 Cấu trúc plasmid pHT43 và chi tiết vùng promoter Pgrac [70] .8 Kỹ thuật điện di DNA trên gel polyacrylamide .9 Kỹ thuật phát hiện protein mục tiêu Western blot .10 Quy trình chung của phương pháp LC-MS/MS [27] .11 Nguyên tắc hoạt động của máy đo khối phổ ESI .12 Các bước chính của máy đo khối phổ [75] .1 Các thang chuẩn sử dụng trong điện di DNA và protein .2 Cấu trúc của phức hệ mini-cellulosome được thiết kế trong luận án.3 Hệ thống các plasmid được thiết kế.4 Quy trình chạy PCR .5 Sơ đồ minh họa quá trình sáp nhập gen mục tiêu vào bộ gen.6 Kỹ thuật ELISA phát hiện tương tác cohesin - dockerin .7 Quy trình phân tích ái lực của CBM và RAC .1 Điện di trên gel agarose sản phẩm PCR thu gen cel8A và cel5CCA (A) .62 vii Danh mục hình Hình 3.2 Sơ đồ cấu trúc plasmid pHT1454 và pHT1757 .3 Vòng phân giải CMC trên đĩa thạch Congo Red .4 Phân tích điện di dịch protein ngoại bào các chủng B. subtilis WB800N mang plasmid pHT1757 và pHT1454 .5 Hoạt tính CMCase ngoại bào của chủng B.

subtilis mang các plasmid.6 Ảnh hưởng của thời gian thu mẫu và nồng độ IPTG đến sự biểu hiện của Cel8A và cCel5CCA .7 Phân tích sản phẩm khuếch đại của pHT1701 trên gel agarose .8 Sơ đồ cấu trúc plasmid pHT1701.9 Kết quả sàng lọc các dòng B. subtilis WB800N mang gen sáp nhập.10 Kết quả phân tích protein mini-CipA .11 Trình tự protein mini-CipA và các peptide phát hiện bằng LC-MS/MS.12 Kết quả khối phổ MS/MS của peptide VTNTGSSAIDLSK. Kết quả ELISA phân tích tương tác cohesin và dockerin.14 Kết quả PCR thu gen cel8A-cbm và PCR khuẩn lạc .16 Các peptide protein Cel8A-CBM được phát hiện bằng LC-MS/MS.17 Kết quả Western blot với kháng thể kháng Cel8A.18 Hoạt tính thủy phân RAC ở 50oC và ở 4oC của các plasmid .19 So sánh các plasmid trước và sau khi ủ với RAC .20 Hoạt tính CMCase khi phối trộn với mini-CipA .21 Hoạt tính CMCase và tỉ lệ S mẫu phối trộn khi có mini-CipA .89 viii Mở đầu MỞ ĐẦU Cellulosome là phức hệ protein ngoại bào có kích thước lớn, phức tạp được biết đến trong tự nhiên do một số vi khuẩn và vi nấm kị khí sinh ra [15, 39, 47].