Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu phát triển kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Trần Thị Lệ Quyên NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÁC KỸ THUẬT MỚI ỨNG DỤNG ĐỂ PHÁT HIỆN VI KHUẨN Burkholderia pseudomallei TRONG CÁC MẪU BỆNH PHẨM LÂM SÀNG VÀ NGOÀI MÔI TRƯỜNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2024 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Trần Thị Lệ Quyên NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÁC KỸ THUẬT MỚI ỨNG DỤNG ĐỂ PHÁT HIỆN VI KHUẨN Burkholderia pseudomallei TRONG CÁC MẪU BỆNH PHẨM LÂM SÀNG VÀ NGOÀI MÔI TRƯỜNG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9420101.07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. Trịnh Thành Trung 2. Bùi Thị Việt Hà Hà Nội - 2024 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cộng tác cùng các cộng sự khác. Các số liệu trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý của các đồng tác giả.

Phần còn lại chưa được công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Tác giả luận án Trần Thị Lệ Quyên LỜI CẢM ƠN Hoàn thành luận án tiến sĩ là dấu mốc đánh dấu sự trưởng thành của nghiên cứu sinh trong giai đoạn đầu của sự nghiệp nghiên cứu khoa học. Luận án là sự nỗ lực học tập và nghiên cứu của nghiên cứu sinh, sự định hướng khoa học của thầy hướng dẫn, sự hỗ trợ của đồng nghiệp trong phòng thí nghiệm và nhiều nguồn lực khác. Tôi xin bày tỏ sự biết ơn chân thành tới tất cả sự hỗ trợ trực tiếp hay gián tiếp đã giúp tôi hoàn thành luận án này.

Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc nhất tới TS. Trịnh Thành Trung, thầy hướng dẫn thứ nhất, người đã đưa tôi đến thế giới “melioidosis” bằng kiến thức chuyên môn sâu rộng với tinh thần đầy nhiệt huyết nghiên cứu khoa học. Thầy không chỉ là người thầy hướng dẫn khoa học giúp tôi định hướng các nghiên cứu đáp ứng chất lượng công bố quốc tế, mà còn là người lãnh đạo quan tâm hỗ trợ tôi trong các nhiệm vụ khoa học khác tại đơn vị. Tôi gửi lời cảm ơn tới PGS.

Bùi Thị Việt Hà, cô hướng dẫn thứ hai, người đã đồng hành nhiều năm với tôi từ bậc học đại học tới các bậc sau đại học. Cô luôn dành cho tôi sự quan tâm hỗ trợ về chuyên môn, tiếp thêm động lực cho tôi hoàn thành luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô tham dự Hội đồng đánh giá luận án các cấp, các thầy cô đã dành thời gian đọc, nhận xét và góp ý để luận án của tôi được hoàn thiện hơn. Để hoàn thành được luận án này, tôi chân thành cảm ơn ThS.

Bùi Nguyễn Hải Linh, người đồng nghiệp đã hết sức tâm huyết giúp tôi hoàn thành nhiều thí nghiệm của luận án. Tôi cũng gửi lời cảm ơn các anh chị em đồng nghiệp tại Viện Vi Sinh vật và Công nghệ sinh học đã luôn động viên và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện luận án cũng như trong công việc nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn các đề tài cấp nhà nước NVQG - 2018/08 và NĐT.GB/20 và đề tài cấp ĐHQGHN QG.57 đã tài trợ cho nghiên cứu của luận án. Tôi cũng xin cảm ơn sự hỗ trợ của BVĐK tỉnh Hà Tĩnh, BVTW Huế và các bệnh nhân tham gia vào nghiên cứu.

Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ của các quý thầy cô tại Bộ môn Vi sinh vật học- Khoa Sinh học, phòng Đào tạo (bộ phận Quản lý sau đại học), trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội về các góp ý chuyên môn cũng như hướng dẫn các thủ tục hành chính để hoàn thành luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Quỹ VINIF, Vingroup đã hỗ trợ một phần kinh phí cho quá trình thực hiện luận án. Cuối cùng, tôi xin biết ơn sự quan tâm, động viên và tạo điều kiện của gia đình và người thân giúp tôi có thời gian và động lực hoàn thành luận án. Hà Nội, ngày 08 tháng 02 năm 2024 Trần Thị Lệ Quyên MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT.

i DANH MỤC CÁC HÌNH .iii DANH MỤC BẢNG. VI KHUẨN Burkholderia pseudomallei VÀ BỆNH NHIỄM TRÙNG MELIOIDOSIS. Giới thiệu về chi vi khuẩn Burkholderia và loài B. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn B.

Bệnh nhiễm trùng melioidosis. Phân bố vi khuẩn B. pseudomallei và ca nhiễm melioidosis. NGHIÊN CỨU VỀ B.

pseudomallei VÀ MELIOIDOSIS TẠI VIỆT NAM. Nghiên cứu về B. Nghiên cứu điều tra ca nhiễm melioidosis. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM VI KHUẨN B.

pseudomallei TỪ MẪU BỆNH PHẨM LÂM SÀNG. Các phương pháp xét nghiệm phụ thuộc nuôi cấy. Các phương pháp xét nghiệm không phụ thuộc nuôi cấy. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN B.

pseudomallei NGOÀI MÔI TRƯỜNG38 1. Phương pháp nuôi cấy. Phương pháp sinh học phân tử. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN…….

Cách tiếp cận của nghiên cứu phát triển kỹ thuật xét nghiệm nhanh melioidosis………………………………………………………………. Các tiếp cận của nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát hiện vi khuẩn B. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…. NGUYÊN VẬT LIỆU.

Hóa chất và thiết bị. Chủng vi khuẩn. Mẫu huyết thanh. Mẫu môi trường.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Kỹ thuật ELISA xét nghiệm nhanh melioidosis. Kỹ thuật nuôi cấy làm giàu phát hiện B. pseudomallei ngoài môi trường.

Định lượng vi khuẩn B. pseudomallei từ mẫu môi trường. Phương pháp phân tích đa hình trình tự các kiểu gen MLST. Thống kê xử lý số liệu.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM NHANH MELIOIDOSIS TỪ MẪU BỆNH PHẨM LÂM SÀNG. Nghiên cứu phát triển kỹ thuật ELISA xét nghiệm nhanh melioidosis. Đánh giá hiệu quả xét nghiệm melioidosis của WC/Hcp1-ELISA.

PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT PHÁT HIỆN B. pseudomallei NGOÀI MÔI TRƯỜNG. Nghiên cứu phát triển kỹ thuật nuôi cấy phát hiện vi khuẩn B. pseudomallei ngoài môi trường.

Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy làm giàu hai bước trong điều tra sự có mặt của B. pseudomallei ngoài môi trường. 111 DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ. 112 LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN.

112 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 113 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt AhpC Alkyl hydroperoxide reductase subunit C API Analytical profile index AUROCC Area under the receiver operating characteristics curve BV TƯ Bệnh viện Trung ương BVĐK Bệnh viện đa khoa BSA Bovine serum albumin CDC Centers for disease control and Trung tâm Kiểm soát và prevention Phòng ngừa Dịch bệnh CDS Coding DNA sequence Trình tự mã hóa CFU Colony forming unit Đơn vị hình thành khuẩn lạc CI Confidence interval CPS Capsule polysaccharide DNA Deoxyribonucleic acid ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay EM Erythritol medium EPS Exopolysaccharide GIs Genomic island Đảo gen Hcp1 Hemolysin co-regulated protein 1 ICT Immunochromatography Test Xét nghiệm sắc ký miễn dịch IHA Indirect hemagglutination assay Ngưng kết hồng cầu gián tiếp iiPCR Insulated isothermal PCR PCR đẳng nhiệt IQR Interquartile range IPTG Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside solution LAMP Loop-mediated isothermal amplification PCR khuếch đại đẳng nhiệt PCR vòng lặp LB Luria-Bertani broth LPS Lipopolysaccharide i Maldi-tof MS Matrix assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry MHA Mueller Hinton agar MLST Multilocus sequence typing Đa hình trình tự các kiểu gen MNGC Multi-nucleated giant cells Tế bào khổng lồ đa nhân MQ Milli-Q Nước cất Milli-Q NST Nhiễm sắc thể NTDs Neglected tropical diseases Các bệnh nhiệt đới mới nổi PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp PVDF Polyvinylidene difluoride OPD O-phenylenediamine dihydrochloride RENOMAB Research network on melioidosis and Mạng lưới nghiên cứu về Burkholderia pseudomallei melioidosis và B. pseudomallei SDS Sodium dimethyl sulfate SDS-PAGE Sodium dimethyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis ST Sequence type Kiểu trình tự TBSS-C50 Threonine-basal salt solution colistin 50 mg/liter TLTK Tài liệu tham khảo TMB 5’5-Tetramethylbenzidine TTSS1 Type III secretion system Hệ thống tiết nhóm III VSV Vi sinh vật VSV&CNSH Vi sinh vật và Công nghệ sinh học VTCC Vietnam type culture collection Trung tâm Nguồn gen Vi sinh vật Quốc gia X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D- galactoside WC Whole cell Toàn tế bào WHO World health organization Tổ chức Y tế thế giới ii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Cây phát sinh chủng loại của B.

pseudomallei và các loài quan hệ họ hàng. Cây được xây dựng dựa trên trình tự gen 16S rRNA của các loài nghiên cứu. Hình thái tế bào vi khuẩn B. Các dạng hình thái khuẩn lạc vi khuẩn B.

pseudomallei trên môi trường thạch Ashdown sau 4 ngày nuôi cấy ở 37oC. Dự đoán về tính phù hợp môi trường đối với sự tồn tại của B. Số liệu bài báo Quốc tế công bố về B. pseudomallei và melioidosis tại Việt Nam từ lúc phát hiện ra ca bệnh đầu tiên năm 1925 đến thời điểm kết thúc chiến tranh năm 1975, dư âm ca bệnh công bố sau chiến tranh và những năm hòa bình lập lại.

Khuẩn lạc vi khuẩn B. pseudomallei và các loài vi khuẩn khác phân lập từ mẫu bệnh phẩm tạp nhiễm trên các môi trường thường quy (Columbia, MacConkey và UTI) và chọn lọc (Ashdown) trong thời gian 1-2 ngày, 37oC. Sơ đồ các bước nuôi cấy phân lập phát hiện sự có mặt của vi khuẩn B. pseudomallei ngoài môi trường theo hướng dẫn chuẩn.

Cấu trúc vector pPSG-IBA3. Vị trí thu mẫu nước ruộng lúa tại Triệu Sơn - Thanh Hóa. Vị trí thu mẫu đất và nước tại Sóc Sơn. Sơ đồ bố trí thí nghiệm phát triển kỹ thuật nuôi cấy làm giàu để phát hiện vi khuẩn B.

pseudomallei ngoài môi trường. Sơ đồ các bước nghiên cứu phát triển kỹ thuật xét nghiệm nhanh melioidosis từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng. Kết quả so sánh trình tự gen BPSL2697 mã hóa protein GroEL từ chủng chuẩn B. pseudomallei K96243 và trình tự gen từ vector nhân dòng sử dụng khuôn DNA của chủng B.

Nhân dòng 3 gen mã hóa các kháng nguyên protein. Biểu hiện của protein tái tổ hợp Hcp1 (1), GroEL1 (2) và AhpC (3) trên tế bào E. coli BL21(DE3) pLysS; sản phẩm tinh sạch của Hcp1 (20,7 kDa) (4); iii GroEL1 (59,1 kDa) (5) và AhpC (22,3 kDa) (6); western blot của protein Hcp1 (7); GroEL1 (8) và AhpC (9) với huyết thanh của bệnh nhân melioidosis. Giá trị OD490 của xét nghiệm ELISA sử dụng các kháng nguyên Hcp1, AhpC và GroEL1 ở dải nồng độ 0,05-3,0 µg/mL.

Giá trị OD490 của các xét nghiệm WC/Hcp1/AhpC/GroEL1-ELISA sử dụng bộ 185 mẫu huyết thanh. Hiệu quả của kỹ thuật làm giàu vi khuẩn B. pseudomallei từ 80 mẫu đất được đánh giá bằng qPCR TTSS1. Hiệu quả của kỹ thuật làm giàu vi khuẩn B.

pseudomallei từ 80 mẫu đất được đánh giá bằng phân lập trên thạch Ashdown. (A) Số mẫu nước dương tính với vi khuẩn B.