Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu virus lưu hành trên dơi ở Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ THU THỦY NGHIÊN CỨU SỰ LƢU HÀNH CỦA MỘT SỐ VIRUS GÂY BỆNH CHO NGƢỜI TRÊN DƠI Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI – 2013 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ THU THỦY NGHIÊN CỨU SỰ LƢU HÀNH CỦA MỘT SỐ VIRUS GÂY BỆNH CHO NGƢỜI TRÊN DƠI Ở VIỆT NAM CHUYÊN NGÀNH : VI SINH VẬT HỌC MÃ SỐ : 62 42 40 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. LÊ THỊ QUỲNH MAI 2. PHẠM VĂN TY HÀ NỘI – 2013 MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Mục lục Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 3 1. Bệnh có nguồn gốc từ động vật 3 1.

Giả thiết về sự xuất hiện và lây truyền bệnh 3 1. Các bệnh lây truyền từ động vật 5 1. Dơi và vai trò truyền bệnh 9 1. Sinh thái, phân loại, phân bố về loài dơi 9 1.

Một số thông tin về khu hệ dơi của Việt Nam 10 1. Vai trò của dơi trong truyền bệnh 18 1. Mốt số bệnh nhiễm trùng mới xuất hiện liên quan đến dơi 19 1. Biện pháp phòng chống bệnh lây truyền từ động vật sang 37 ngƣời 1.

Chủ động giám sát bệnh 37 1. Kiểm soát vật chủ, vectơ, ổ chứa của tác nhân truyền bệnh 38 1. Các phƣơng pháp phát hiện và xác định virus ở loài dơi 39 1. Phân lập virus 39 1.

Huyết thanh học 40 CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2. Đối tƣợng, cỡ mẫu, địa điểm, thời gian nghiên cứu 42 2. Mẫu dơi thu thập trong nghiên cứu 42 2. Mẫu máu của ngƣời khỏe mạnh tham gia nghiên cứu 43 2.

Mẫu nghiên cứu 43 2. Trang thiết bị và dụng cụ 44 2. Phƣơng pháp 48 2. Định loại dơi ngoài thực địa 48 2.

Kỹ thuật hấp phụ miễn dịch liên kết enzym (ELISA) tóm bắt 49 IgG 2. Kỹ thuật xác định kháng thể trung hòa 55 2. Phương pháp xác định một số yếu tố liên quan đến khả năng 59 lây truyền virus từ dơi sang người 2.Phương pháp xử lý số liệu 59 2. Đạo đức trong nghiên cứu 59 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 61 3.

Dấu vết kháng thể kháng các virus Nipah, SARS-CoV, 61 Banna, Viêm não Nhật Bản, Chikungunya ở loài Dơi tại Việt Nam 3. Thời gian, địa điểm thu thập mẫu dơi 61 3. Các loài dơi thu thập trong nghiên cứu 63 3. Kết quả xác định một số tác nhân gây bệnh cho ngƣời liên 69 quan đến dơi bằng phƣơng pháp huyết thanh học 3.

Mối liên quan giữa các virus gây bệnh truyền nhiễm cho ngƣời 90 với các họ/ loài dơi 3. Khả năng phơi nhiễm các virus có vật chủ là loài dơi ở một 98 số nhóm ngƣời có yếu tố liên quan về dịch tễ 3. Phát hiện kháng thể kháng virus Nipah ở mẫu huyết thanh 99 nguời bằng phƣơng pháp huyết thanh học 3. Phát hiện kháng thể kháng SARS –CoV ở mẫu huyết thanh 102 nguời bằng phƣơng pháp huyết thanh học 3.

Một số yếu tố nguy cơ liên quan đến khả năng truyền virus 104 Nipah sang ngƣời tại Tây Nguyên KẾT LUẬN 112 KIẾN NGHỊ 114 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN ARN Acid ribonucleic ATSH An toàn sinh học BSL – 3 Biosafety level III (Phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp độ 3) CDC The US Center of Diseases Control and Prevention (Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Mỹ) CPE Cytopathic effects (Hiệu ứng hủy hoại tế bào) DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium (Môi trường nuôi cấy tế bào) ELISA Enzyme linked Immunosorbent Assay (Kỹ thuật miễn dịch hấp phụ gắn enzym) FBS Fetal Bovine Serum (Huyết thanh bào thai bê) HEV Hendra Virus IFA Immunofluorescent Assay (Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang) NiV Nipah virus NT50 50% CPE Neutralization test (Phản ứng trung hòa gây hủy hoại 50% tế bào) PBS Phosphate Buffered Saline (Dung dịch đệm PBS) RT- PCR Reverse transcriptase – Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymeraza phiên mã ngược) SARS Severe acute respiratory syndrome (Hôi chứng viêm đường hô hấp nặng) SXH Sốt xuất huyết SHPT Sinh học phân tử TCID50 Tissue culture infectious dose (liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy) TTYTDP Trung tâm Y tế dự phòng VNNB Viêm não Nhật Bản VSDTTU Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng WB Western Blot WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Hệ thống phân loại dơi trên thế giới và Việt Nam 11 1.2 Các loại dơi quả - Pteropodidae lƣu hành ở Việt Nam 12 1.3 Các loài dơi muỗi- Vespertilionidae lƣu hành ở Việt Nam 15 3.1 Số lƣợng mẫu dơi thu thập: 2006-2009 61 3.2 Các họ/loài dơi (Chiroptera) trong nghiên cứu 66 3.3 Các loài dơi lƣu hành tại các điểm nghiên cứu 67 3.4 Kết quả xác định kháng thể IgG kháng virus Nipah bằng kỹ 72 thuật ELISA 3.5 Kết quả xác định kháng thể IgG kháng Nipah bằng phản ứng 74 trung hòa (NT50) 3.6 Kết quả xác định kháng thể IgG kháng virus SARS-CoV 79 bằng kỹ thuật ELISA 3.7 Kết quả xác định kháng thể IgG kháng SARS – CoV bằng 80 phản ứng trung hòa (NT50) 3.8 Kết quả xác định kháng thể IgG kháng virus Banna bằng kỹ 83 thuật ELISA 3.9 Kết quả xác định kháng thể IgG kháng virus Banna bằng 85 phản ứng trung hòa (NT50) 3.10 Kết quả xác định kháng thể IgG kháng virus VNNB và 87 Chikungunya bằng kỹ thuật ELISA 3.11 Kết quả xác định kháng thể IgG kháng virus VNNB bằng 88 phản ứng trung hòa (NT50) 3.12 Kết quả xác định kháng thể IgG kháng virus Chikungunya 88 bằng phản ứng trung hòa (NT50) 3.13 Bảng tổng hợp kết quả các mẫu huyết thanh dơi chứa kháng 94 thể IgG kháng virus Nipah, SARS - CoV, Banna, JE và Chikungunya 3.14 Kết quả xác định kháng thể IgG kháng virus Nipah ở ngƣời 99 tình nguyện tại khu vực Tây Nguyên bằng kỹ thuật ELISA 3.15 Kết quả xác định kháng thể IgG kháng virus Nipah ở ngƣời 100 tình nguyện tại khu vực Tây Nguyên bằng phản ứng trung hòa 3.16 Kết quả xác định kháng thể IgG kháng SARS-CoV ở ngƣời 101 tình nguyện tại khu vực Tây Nguyên bằng kỹ thuật ELISA 3.17 Kết quả xác định kháng thể IgG kháng virus SARS-CoV ở 103 ngƣời tình nguyện tại khu vực Tây Nguyên bằng phản ứng trung hòa 3.18 Kết quả khảo sát bằng bộ câu hỏi in sẵn ở nhóm ngƣời tình 106 nguyện DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Cây phát sinh chủng loại của Bộ Dơi 9 1.2 Bản đồ phân bố dơi trên thế giới 9 1.3 Rousettus leschenaultia - Dơi cáo nâu 12 1.4 Cynopterus sphinx- Dơi chó cánh dài 12 1.5 Scotophilus kuhlii- Dơi nâu 17 1.6 Chaerephon plicata – Dơi thò đuôi 18 1.7 Phân nhóm Henipah dựa trên phân tích vật liệu di truyền 22 1.8 Mô hình cấu trúc virion của virus Niv 23 1.9 Phân nhóm Corona dựa trên phân tích Vật liệu di truyền 25 1.10 Mô hình cấu trúc virion virus SARS – CoV 27 1.11 Mô hình cấu trúc hạt virion của virus Banna, nhóm 29 Coltivirus 1.12 Mô hình cấu trúc hạt virion của nhóm Flavivirus 33 1.13 Mô hình cấu trúc hạt virion của nhóm Alphavirus 36 2.1 Các địa điểm thu thập bệnh phẩm dơi trong nghiên cứu 42 2006-2009 2.2 Lƣới mờ sử dụng để bắt dơi ở khu vực nông trƣờng 45 2.3 Bẫy thụ cầm kết hợp với lƣới mờ thu mẫu dơi ở khu vực 46 hang 2.4 Sử dụng vợt cầm tay để thu mẫu dơi trên tán lá cây 47 2.5 Hình thái cơ thể dơi 48 2.6 Nguyên lý phản ứng ELISA phát hiện kháng thể IgG 49 2.7 Sơ đồ mẫu xét nghiệm ELISA trên huyết thanh dơi 53 2.8 Sơ đồ mẫu xét nghiệm ELISA trên huyết thanh ngƣời 53 2.9 Quy trình thực hiện phản ứng NT50 54 3.1 Sự phân bố của các loài dơi thu thập trong nghiên cứu 64 3.2 Dơi thu thập theo tháng tại địa điểm nghiên cứu từ 2006- 68 2009 3.3 Dơi cáo nâu có tên khoa học Rousettus leschenaulti 74 thuộc họ dơi ăn quả 3.4 Mẫu huyết thanh dơi có IgG kháng virus Nipah, SARS – 95 CoV, Banna, VNNB và Chikungunya 3.5 Mẫu huyết thanh dơi chứa kháng thể trung hòa (NT50) 97 kháng virus Nipah và SARS- CoV 3.6 Kết quả khảo sát bằng bộ câu hỏi dành cho ngƣời tham 107 gia nghiên cứu tại Tây Nguyên MỞ ĐẦU Trong quá trình tồn tại, phát triển và tiến hóa của loài ngƣời, động vật luôn gắn bó mật thiết, không thể tách rời từ thời kỳ nguyên thủy đến cuộc sống hiện đại ngày nay. Từ những loài động vật hoang dại là nguồn cung cấp thực phẩm trong thời kỳ nguyên thủy, thông qua các phƣơng thức săn bắn, đến các động vật thuần hóa, trở thành vật nuôi trong gia đình, động vật luôn phát triển và tiến hóa đồng thời với sự phát triển và tiến hóa của loài ngƣời. Sự gắn bó mật thiết nhƣ vậy cũng chính là cơ chế để lây truyền bệnh từ động vật sang ngƣời hoặc ngƣợc lại. Một số bệnh, dịch bệnh trên ngƣời đã đƣợc xác định có nguồn gốc từ động vật nhƣ: bệnh dại, bệnh than, sốt tularemia, viêm não miền Tây sông Nile (West –Nile).

và gần đây một số bệnh nhiễm trùng mới xuất hiện đang thu hút sự quan tâm của các nhà nghiên cứu trên thế giới nhƣ: cúm gia cầm (A/H5N1); viêm đƣờng hô hấp cấp tính nặng SARS- CoV đều có các yếu tố liên quan đến các bệnh của động vật [10,34,116]. Bộ Dơi (Chiroptera) là bộ có số lƣợng loài nhiều thứ 2 trong lớp thú, với khoảng 1.100 loài, chiếm 20% trong tổng số 4.600 loài động vật có vú và phân bố rộng rãi trên thế giới [33, 74]. Dơi đƣợc biết nhƣ một loài thú cổ đại nhất, xuất hiện khoảng 50-52 triệu năm trƣớc đây [74]. Kết quả phân tích di truyền học của các loài thú cho thấy dơi, ngựa, chó, cá voi là những động vật có đặc điểm di truyền gần với các loài thuộc Bộ Linh trƣởng (ngƣời, khỉ, vƣợn).

Trong tổng số trên 60 loại virus đƣợc báo cáo có liên quan đến dơi thì 59 virus có vật liệu di truyền là ARN, đƣợc xác định là có khả năng tiềm tàng gây bệnh cho ngƣời. Những tác nhân quan trọng đƣợc nhắc tới là: virus Lysa, virus Hendra, virus Nipah, SARS-CoV, Ebola. Sự liên quan của các tác nhân virus đã biết trên một số loài dơi cụ thể gợi ý một sự lan truyền tác nhân virus gây bệnh từ dơi (trong vai trò vật chủ chính) sang ngƣời. Để tìm hiểu phƣơng 1 thức lây truyền, vật chủ đầu tiên, khả năng gây bệnh, các yếu tố nguy cơ nhiễm bệnh trong quần thể ngƣời.