Luận án: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic kháng vi sinh vật gây bội nhiễm mụn trứng cá

TÓM LƯỢC Việc sử dụng sản phẩm bôi da có chứa corticoid đã mang lại nhiều tác dụng phụ như: teo da, mụn trứng cá tái diễn nhiều lần, gia tăng bội nhiễm bởi nhiều vi sinh vật. Đề tài thực hiện với mục tiêu tìm kiếm những dòng vi khuẩn lactic (LAB) có khả ức chế vi khuẩn tham gia sinh mụn và vi sinh vật bội nhiễm ở mụn trứng cá sử dụng sản phẩm bôi chứa corticoid, định hướng đưa ra phương pháp chăm sóc da mụn trứng cá theo hướng cạnh tranh sinh học. Qua khảo sát trên 148 bệnh nhân mụn trứng cá tình nguyện cho thấy tỷ lệ mụn trứng cá sử dụng sản phẩm bôi chứa corticoid chiếm 53,4%. Trong đó, nữ chiếm tỷ lệ cao hơn nam (nữ: 58,8%; nam: 43,1%).

Dạng lâm sàng phổ biến ở nhóm sử dụng sản phẩm bôi chứa corticoid là mụn trứng cá đỏ chiếm 44,3%. Tỷ lệ nhiễm P. acnes trên mụn trứng cá sử dụng sản phẩm bôi chứa corticoid là 56,8%, S. aureus là 60,8%, nhiễm ký sinh trùng Demodex là 8,9% và tỷ lệ nhóm vi khuẩn đồng nhiễm gồm P.

Các dòng vi khuẩn phân lập từ mụn trứng cá sử dụng sản phẩm bôi chứa corticoid đều kháng với các kháng sinh dùng trong điều trị mụn gồm: erythromycin, clindamycin, doxycyclin, tetracyclin, oxacillin và Trimethoprim/sulfamethoxazol với mức kháng từ 55,6% đến 95,4%. Bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch có cải tiến và chủng vào dịch nuôi vi khuẩn sinh mụn và vi khuẩn bội nhiễm ở mụn trứng cá sử dụng sản phẩm bôi chứa corticoid gồm P. aureus để đánh giá khả năng kháng khuẩn của LAB. Kết quả đã chọn được dòng L.

plantarum 05SL3 có nguồn gốc từ da người không bị mụn trứng cá, có khả năng ức chế vi khuẩn chỉ thị với khoảng vô khuẩn đối với P. acnes là 18 mm, S. aureus là 8 mm. Khả năng làm giảm mật số P.

acnes 46Pa sau 30 giờ là 60,2%, S. epidermidis 09Se là 47,3% và S. aureus 10Sa là 48,6% so với đối chứng. Qua kiểm tra đặc tính sinh học, vi khuẩn L.

plantarum 05SL3 thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, tế bào hình que có kích thước 2,26x0,61 µm, sắp xếp đơn hoặc chuỗi ngắn, oxidase và catalase âm tính, có khả năng phát triển ở nhiệt độ 50 oC, sản xuất acid lactic đạt 14,23 g/L với hiệu suất sử dụng glucose là 84% ở nhiệt độ 37 oC, không sinh bacteriocin, khả năng chống oxy hóa với IC50 là 31,18% thấp hơn vitamin C 1,75 lần, khả năng giữ ẩm tương đương với glycerin 5% và kháng với các kháng sinh như: tetracyclin, oxacillin, erythromycin, climdamycin, doxycyclin, trimethoprim/ sulfamethoxazol. i Lactobacillus plantarum 05SL3 có thể nuôi sinh khối trong môi trường nước tàu hũ và đường saccarose với hiệu suất đạt 69,23% (2,7 g/L) so với môi trường MRS (3,9 g/L) (p<0,001) và lên men gel Nha đam với tỷ lệ thành phần: gel Nha đam 30%; sữa đặc có đường 2% và 1% Lactobacillus plantarum 05SL3 tạo chế phẩm Lp. Gel chăm sóc da có chứa mật số vi khuẩn 4,7x108 CFU/mL sau 40 ngày trữ ở nhiệt độ 25 oC (p<0,001). Từ khóa: chế phẩm Lp.

Gel, Lactobacillus plantarum 05SL3, mụn trứng cá. Propionibacterium acnes; Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, ii ABSTRACT The using topical corticosteroid on the skin has shown many side effects such as atrophy, recurring acne, infecting of many microorganisms. The objectives of this research were to isolate and select lactic acid bacteria (LAB) with the capacity of inhibiting the growth of infectting acne microorganisms, as well as to develop skin-care method by bio-competitive. The survey of 148 voluntary acne patients showed 53.4% of using topical corticosteroid.

Of which, the females ratio were 58.8% and males ratio were 43. The regular clinical of using topical corticosteroid was acne vulgaris (44. The infection ratio of P.8% and Demodex was 8. The regular of bacterial infections are P.

aureus with ratio was 45. The three kinds of acne-causing bacteria including P. aureus were highly resistant to erythromycin (Er), doxycycline (Dx) andtrimethoprim / sulfamethoxazole (Bt) with resistance rate to73% from 95.4% By using the diffusion method testing on agar plates and the inoculation of LAB strain was tested on acne-causing bacteria grown in trypticase and heart extract broth medium at 30h incubation time. The results selected L.

plantarum 05SL3 from human skin without acne. plantarum 05SL3 was capable of inhibiting with clear-area distances from 18mm, 8mm, 8mm depending on kind of acne-causing bacteria tested. After 30h of incubation, the population of S. aureus was reduced to 48.

epidermidis was reduced 47. acens was reduced 60.2% in comparison to the control. plantarum 05SL3 had rod-shaped, 2.61m, single or short chain, Gram-positive; oxidase and catalase negative, growing at 50 oC, using glucose, lactose, or saccharose for growth, producing lactic acid of 14.23 g / L with yield was 84% at 37 oC, not bacteriocin, antioxidant with an IC50 of 31 18% was lower than vitamin C 1. The ability to moisten of L.

plantarum 05SL3 was the same to glycerin at 5%. plantarum 05SL3 was antibiotic resistance such as: tetracycline, oxacillin, erythromycin, climdamycin, doxycyclin, trimethoprim / sulfamethoxazole. The Lactobacillus plantarum 05SL3 able to grow in the culture including whey soybean and saccarose with biomass production was 2.7g/L, the yield was 69.23% in comparison to yield in MRS broth. plantarum was able to fermented in Aloe vera gel 30%, plus 2% of sweetened iii condensed milk and 1% Lactobacillus plantarum 05SL3.

aloe vera gel contains the Lp.7 x 108 CFU/mL after 40 days store at 25 oC. Keywords: Acne; Lp. Aloe vera gel, Lactobacillus plantarum 05SL3, Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus, Staphylococcu sepidermidis; iv LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân dưới sự chỉ dẫn của Thầy hướng dẫn. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình luận án nào trước đây.

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TÁC GIẢ LUẬN ÁN PGS. NGUYỄN VĂN BÁ DƯƠNG THỊ BÍCH v LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn Quý Thầy hướng dẫn đã tận tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi thực hiện luận án này. Xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô của Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học, Trường Đại Học Cần Thơ và các anh chị cán bộ y tế của Bệnh viện Da Liễu Cần Thơ đã giúp đỡ trong quá trình làm các thí nghiệm cho luận án. Xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo và anh, chị đồng nghiệp của Trường Đại học Tây Đô đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi tiến hành luận án.

vi MỤC LỤC Trang TÓM LƯỢC. iii LỜI CAM ĐOAN. vi DANH SÁCH BẢNG. ix DANH SÁCH HÌNH.

xi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT. xiii GIỚI THIỆU. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Tổng quan về mụn trứng cá.

Phân loại mụn trứng cá. Cơ chế gây mụn trứng cá. Vi sinh vật bội nhiễm ở mụn trứng cá. Vi khuẩn Propionibacterium acnes.

Vi khuẩn Staphylococcus aureus. Vi khuẩn Staphylococcus epidermidis. Ký sinh trùng Demodex. Ảnh hưởng của corticoid bôi đối với mụn trứng cá.

Sơ lược về vi khuẩn lactic và những ứng dụng trong chăm sóc da. Một số đặc điểm chung của vi khuẩn lactic. Những ứng dụng của vi khuẩn lactic trong y học. Tiềm năng ứng dụng vi khuẩn lactic trong chăm sóc da.

Sơ lược về Nha đam và những ứng dụng trong mỹ phẩm. Sơ lược về đặc điểm sinh học của Nha đam. Những ứng dụng của Nha đam trong mỹ phẩm. Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn.

Phương pháp phân lập vi khuẩn. Định danh vi khuẩn bằng các kỹ thuật truyền thống. Định danh vi khuẩn bằng giải trình tự gen 16S-rRNA. Kỹ thuật giải trình tự gen 16S-rRNA.

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Phương tiện nghiên cứu. Môi trường phân lập, nuôi cấy vi sinh vật và hóa chất. Phương pháp nghiên cứu.

Khảo sát tần suất xuất hiện của P. epidermidis, Demodex trên da mụn trứng cá sử dụng sản phẩm bôi chứa corticoid. Khảo sát sự đề kháng kháng sinh của nhóm vi khuẩn bội nhiễm phổ biến ở mụn trứng cá sử dụng sản phẩm bôi chứa corticoid và tuyển chọn vi khuẩn làm chỉ thị. Phân lập và tuyển chọn những dòng LAB có khả năng ức chế vi khuẩn chỉ thị.

Khảo sát một số đặc tính sinh học ứng dụng trong chăm sóc da của dòng LAB đã chọn. Lên men gel Nha đam làm chế phẩm chăm sóc da. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. Khảo sát tần suất xuất hiện của P.

epidermidis, Demodex trên da mụn trứng cá sử dụng sản phẩm bôi chứa corticoid. Đặc điểm mẫu nghiên cứu. Tình hình sử dụng sản phẩm bôi chứa corticoid ở mụn trứng cá. Tỷ lệ bội nhiễm vi sinh vật ở mụn trứng cá sử dụng sản phẩm bôi chứa corticoid.

Khảo sát khả năng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn bội nhiễm ở mụn trứng cá sử dụng sản phẩm bôi chứa corticoid. Kết quả kháng sinh đồ. Kết quả định danh vi khuẩn bội nhiễm ở mụn trứng cá bằng giải trình tự gen 16S-rRNA. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng ức chế vi khuẩn chỉ thị.

Phân lập vi khuẩn lactic. Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn chỉ thị của các dòng LAB phân lập. Khảo sát một số đặc tính sinh học ứng dụng trong chăm sóc da của L. Khả năng sinh bacteriocin bằng phương pháp nhỏ giọt.

Khả năng sinh acid lactic. Khả năng sinh hoạt chất chống oxy hóa. Khả năng giữ ẩm. Khả năng kháng kháng sinh.

Lên men gel Nha đam làm chế phẩm chăm da. Thiết kế môi và điều kiện trường nuôi sinh khối L. Lên men làm chế phẩm chăm sóc da. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.

103 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 104 viii DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 2.1 Tiêu chuẩn đánh giá mức độ ức chế vi khuẩn của kháng sinh………………………………………………………… 43 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR……………………………….3 Bố trí thí nghiệm khảo sát ức chế vi khuẩn chỉ thị của LAB 48 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng thử nghiệm DPPH………………….5 Thành phần dinh dưỡng của nước tàu hũ………………….6 Thành phần môi trường nuôi LAB………………………… 54 Bảng 2.7 Tỷ lệ thành phần môi trường nuôi LAB…………………… 54 Bảng 2.8 Điều kiện nuôi LAB……………………………………….9 Tỷ lệ các thành phần trong chế phẩm…………………….10 Mật số vi khuẩn trong chế phẩm………………………….1 Phân bố bệnh theo lứa tuổi và giới tính…………………… 60 Bảng 3.2 Tỷ lệ biểu hiện các dạng lâm sàng………………………… 61 Bảng 3.3 Tỷ lệ mụn trứng cá có sử dụng corticoid………………….4 Kết quả kiểm tra corticoid trong 18 sản phẩm bôi………… 62 Bảng 3.5 Phân bố bệnh theo biểu hiện lâm sàng và sử dụng mỹ phẩm……………………………………………………….6 Tỷ lệ nhiễm Demodex trên bệnh nhân mụn trứng cá……… 66 Bảng 3.7 Tỷ lệ nhiễm P. acnes trên mụn trứng cá………………….8 Tỷ lệ nhiễm S.aureus trên mụn trứng cá………………….9 Tỷ lệ nhiễm S. epidermidis trên mụn trứng cá…………….10 Tỷ lệ đồng nhiễm các nhóm vi khuẩn trên mụn trứng cá….11 Kết quả kháng sinh đồ của vi khuẩn S.12 Kết quả kháng sinh đồ của vi khuẩn S.