Luận án Tiến sĩ: Căn nguyên dịch cúm người đầu 2000s tại miền Bắc Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN LÊ KHÁNH HẰNG NGHIÊN CỨU CĂN NGUYÊN CỦA CÁC VỤ DỊCH CÚM NGƯỜI ĐẦU NHỮNG NĂM 2000 TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI – 2010 MỤC LỤC Mục lục Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………………. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN……………………………………………. Đặc điểm chung. Hình thái và cấu trúc virút cúm……………………………………………….

Cấu trúc phân tử và chức năng………………………………………………. Cơ chế nhân lên của virút……………………………………………………. Tính đa dạng về vật liệu di truyền và sự tiến hóa của virút cúm A……. Sự tiến hóa của virút cúm B…………………………………………………… 12 1.

Tình hình dịch cúm trên thế giới……………………………………. Tình hình dịch cúm tại Việt Nam……………………………………. Đặc điểm lâm sàng và sinh bệnh học. Thời gian ủ bệnh……………………………………………………………….

Thời gian khởi phát……………………………………………………………. Sinh bệnh học…………………………………………………………………. Dịch tễ học bệnh cúm…………………………………………………. Phương thức và thời gian lây truyền……………………………………….

Nguồn bệnh và ổ chứa………………………………………………………… 19 1. Tính cảm nhiễm và đáp ứng miễn dịch……………………………………. Biện pháp dư phòng và kiểm soát bệnh cúm………………………… 20 1. Thuốc kháng virút…………………………………………………………….

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm…………………………………. Phương pháp phát hiện kháng nguyên……………………………………… 25 1. Phương pháp phát hiện vật liệu di truyền …………………………………. Phương pháp phát hiện kháng thể………………………………………….

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……. Đối tượng nghiên cứu……………………………………………………. Định nghĩa ca bệnh……………………………………………………………. Cỡ mẫu, thời gian và địa điểm……………………………………………….

Mẫu bệnh phẩm………………………………………………………………. Các chủng virút mẫu chứng…………………………………………………. Trang thiết bị và dụng cụ………………………………………………………. Phương pháp……………………………………………………………… 40 2.

Phân lập virút…………………………………………………………………… 40 2. Định typ virút bằng phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HI)…………… 43 2. Phương pháp (RT-PCR)………………………………………………………. Phương pháp Real-time RT-PCR…………………………………………….

Phương pháp xác định trình tự gen……………. Phương pháp xử lý số liệu…………………………………………. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN…………………………….

Các vụ dịch cúm xảy ra tại Hà Nội và Miền Bắc Việt Nam, 2001- 2009…………………………………………………………………………. Giám sát sự lưu hành của virút cúm mùa tại Hà Nội, 2001-2005………. Dịch cúm mùa tại Miền Bắc, Việt Nam 2006 – 2008………………. Dịch cúm lây truyền từ gia cầm sang người do virút cúm A/H5N1 tại miền Bắc Việt Nam, 6/2003 – 5/2009……………………………………………….

Căn nguyên các vụ dịch cúm mùa, 2001 – 2008…………………. Căn nguyên các vụ dịch cúm tại Hà Nội, 2001-2005……………………. Căn nguyên các vụ dịch cúm mùa tại miền Bắc, 2006-2008……………. Đặc điểm di truyền học của virút cúm mùa, 2001-2007…………………… 69 3.

Đặc tính kháng nguyên của virút cúm theo mùa, 2001-2008……………… 85 3. Căn nguyên gây viêm phổi nặng do virút A/H5N1 tại Miền Bắc Việt Nam, 6/2003-5/2009…………………………………………………………… 88 3. Một số đặc điểm chung………………………………………………………… 88 3. Phân lập virút cúm A/H5N1 bằng phương pháp gây nhiễm trên tế bào MDCK…………………………………………………….

Đặc tính tiến hóa của virút cúm A/H5N1 tại Miền Bắc Việt Nam, 6/2003 – 5/2009………………………………………………………………………. 118 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ARN Axit Ribonucleic ADN Axit DeoxyRibonucleic CDC Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm Phòng ngừa và kiểm soát bệnh, Mỹ) CPE Cytopathogenic effect (Tác dụng gây hủy hoại cho tế bào) ELISA Enzyme linked – immusorbent assay (Thử nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn enzyme) HI Hemagglutination Inhibition Test (Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu) IFA Immunofluorescent Assay (Thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang) ILI Influenza Like Illness (Hội chứng Cúm) KN Kháng nguyên (Antigen) KT Kháng thể (Antibody) MN Microneutralization test (Phản ứng trung hoà vi lượng) RT-LAMP Reverse transcriptase-Loop-mediated isothermal amplification-RT- LAMP (Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng phiên mã ngược) RT-PCR Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction (Phương pháp sao chép ngược chuỗi polymerase) TCYTTG Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization) DANH MỤC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1. Các phân đoạn ARN của virút cúm và chức năng………………. Nguồn gốc virút cúm gây ra các vụ đại dịch thế kỷ XX………….

Các đợt dịch cúm A/H5N1 trên người tại Việt Nam……………… 15 2. Số bệnh nhân hội chứng cúm tại Miền Bắc Việt Nam, 2001- 2008………………………………………. Số bệnh nhân viêm phổi nặng nghi nhiễm virút cúm A/H5N1 tại Miền Bắc Việt Nam, 6/2003-5/2009……………………………… 34 2. Hệ thống mồi sử dụng để phát hiện vật liệu di truyền virút cúm bằng phương pháp RT-PCR……………………………………….

Hệ thống mồi và probe sử phát hiện virút cúm A/H5N1 bằng phương pháp Realtime RT-PCR……………………………. Kết quả phân lập virút cúm theo mùa tại Hà Nội, 2001-2005……. Kết quả xác định sự lưu hành của virút cúm theo mùa tại Miền Bắc, 2006-2008 bằng phương pháp RT-PCR…………. Kết quả xác định bệnh nhân nhiễm virút cúm A/H5N1 bằng phương pháp RT-PCR tại một số tỉnh Miền Bắc Việt Nam, 6/2003 - 5/2009…………………………………………………………….

Kết quả xác định các phân týp virút cúm tại Hà Nội, 2001-2005 64 bằng phương pháp HI……………………………………………. Căn nguyên các vụ dịch cúm theo mùa tại Hà Nội, 2001- 65 2005…………………………………………………………. Kết quả xác định sự lưu hành của các phân týp virút tại Miền Bắc 67 Việt Nam 2006 – 2008 bằng phương pháp RT-PCR……………… 3. Căn nguyên các vụ dịch cúm theo mùa tại Miền Bắc Việt Nam, 68 2006 – 2008……………………………………………………….

Số chủng virút cúm giải trình tự nucleotide gen HA và NA tại 70 Miền Bắc Việt Nam, 2001 – 2007……………………………. Phân nhóm vật liệu di truyền gen HA và NA virút A/H1N1 theo năm, 2001-2006. Phân nhóm vật liệu di truyền gen HA và NA virút A/H3N2 theo năm, 2001 – 2006. Kết quả đăng ký trình tự gen mã hóa HA và NA của virút cúm mùa A/H1N1……………………………………………………… 82 3.

Kết quả đăng ký trình tự gen mã hóa HA và NA của virút cúm mùa A/H3N2……………………………………………………… 84 3. Đặc tính kháng nguyên của virút cúm theo mùa, 2001-2008. Thành phần vắc xin cúm tại Bắc Bán cầu theo khuyến cáo của TCYTTG, 2000-2010………………………………………. Phân bố các trường hợp mắc cúm A/H5N1 theo giới……….

Phân bố các trường hợp mắc cúm A/H5N1 theo tuổi. Tỷ lệ tử vong/mắc của bệnh nhân nhiễm virút cúm A/H5N1 tại miền Bắc, Việt Nam, 6/2003 - 5/2009……………………………. Sự phân bố các trường hợp nhiễm virút cúm A/H5N1 theo tháng…………………………………………………………. Kết quả phân lập virút cúm A/H5N1 tại Miền Bắc Việt Nam, 6/2003- 5/2009…………………………………………………….

So sánh kết quả phản ứng Realtime RT –PCR và kết quả phân lập virút cúm A/H5N1, 2007. Số lượng chủng virút cúm A/H5N1 giải trình tự chuỗi nucleotide gen HA và NA, 6/2003-5/2009…………………………………… 98 3. So sánh sự tương đồng trình tự axit amin trên gen HA của virút cúm A/H5N1 clade 1……………………………………………… 108 3. So sánh sự tương đồng trình tự axit amin trên gen HA của virút cúm A/H5N1, 2007…………………………………….

So sánh sự tương đồng trình tự axit amin trên gen HA của virút cúm A/H5N1, 2008……………………………………. 109 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Virút cúm (Influenza virus) là tác nhân chính gây ra các vụ dịch cúm hàng năm tại các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới với tỷ lệ mắc và tử vong cao [66]. Các vụ dịch cúm xảy ra thường do sự thay đổi tính kháng nguyên. Virút cúm A có ổ chứa tự nhiên là các loài chim hoang dại, các động vật có vú và người [101, 132, 133].

Các biến đổi trong vật liệu di truyền (đột biến) hoặc sự pha trộn các phân đoạn gen của virút cúm A khác nhau khi cùng đồng nhiễm trên một tế bào (trao đổi và tích hợp - reassortment) đã dẫn tới sự thay đổi kháng nguyên: thay đổi nhỏ kháng nguyên (antigenic drift) hoặc thay đổi lớn kháng nguyên (antigenic shift) [19, 57]. Đó chính là nguyên nhân gây ra các vụ dịch lẻ tẻ hoặc đại dịch cúm. Lịch sử đã ghi nhận các vụ đại dịch cúm xảy ra trong thế kỷ XX như đại dịch cúm Tây Ban Nha năm 1918 (A/H1N1), đại dịch cúm Châu Á năm 1957 (A/H2N2), đại dịch cúm Hồng Kông năm 1968 (A/H3N2)…là do sự trao đổi vật liệu di truyền giữa virút cúm người và virút cúm gia cầm [62, 133]. Giám sát sự thay đổi đặc tính kháng nguyên của virút cúm sẽ cung cấp các thông cần thiết cho mạng lưới giám sát cúm toàn cầu (Global Influenza Surveillance System - GISS) trong việc phát triển vắc xin phòng cúm để nâng cao hiệu quả bảo vệ của vắc xin cúm.

Dịch cúm gia cầm do virút cúm A/H5N1 độc lực cao đã xuất hiện tại Hàn Quốc tháng12/2003 và lan rộng sang một số nước Châu Á đang là mối quan tâm lo ngại hàng đầu. Cuối năm 2003, dịch cúm gia cầm A/H5N1 đã xuất hiện tại Việt Nam. Từ tháng 1/2004 đến nay, dịch đã xuất hiện ở 61 tỉnh/thành trong cả nước với số gia cầm đã tiêu hủy là hơn 50 triệu con trong tổng số 300 triệu gia cầm mắc bệnh. Phần lớn các chủng virút cúm gây nên các vụ đại dịch đều bắt nguồn từ miền Nam Trung Quốc, nơi được xem là trung tâm dịch (epicenter) [110, 111].

Chủng virút cúm A/H5N1 độc lực cao (HPAI) lây truyền từ gia cầm sang người đầu tiên xuất hiện tại Hồng Kông năm 1997 có nguồn gốc từ chủng A/goose/Guangdong/1/96, với 18 trường hợp mắc, trong đó có 6 trường hợp tử vong. Tính đến nay (5/2009), đã có 15 quốc gia và vùng lãnh thổ xuất hiện virút 2 cúm A/H5N1 trên người với 436 trường hợp mắc và 262 trường hợp tử vong, chiếm tỷ lệ 60% [146]. Việt Nam là nước thứ hai trên thế giới xuất hiện virút cúm A/H5N1 trên người (26/12/2003). Kể từ trường hợp mắc đầu tiên cho đến nay (5/2009) tại Việt Nam có 111 trường hợp được xác định nhiễm cúm A/H5N1 với 56 ca tử vong, chiếm tỷ lệ 50,5%.

Dịch xảy ra tại 36/64 tỉnh/ thành phố. Sự lưu hành đồng thời virút cúm theo mùa (A/H1N1, A/H3N2 và B) và virút cúm A/H5N1 tại Việt Nam cũng như một số nước khác trên thế giới đã gây nên mối lo ngại về khả năng xuất hiện chủng virút cúm mới, có khả năng lây truyền dễ dàng từ người sang người. Vì vậy, giám sát sự lưu hành của các chủng virút cúm mùa và virút cúm A/H5N1 cũng như theo dõi đặc điểm di truyền học, sự biến đổi tính kháng nguyên là hết sức cần thiết. Xuất phát từ lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu căn nguyên của các vụ dịch cúm người đầu những năm 2000 tại Miền Bắc Việt Nam ” Với mục tiêu: 1.

Xác định căn nguyên của các vụ dịch cúm trong giai đoạn 2001-2009. Tìm hiểu đặc điểm di truyền học, tính kháng nguyên của các chủng virút cúm mùa A/H1N1, A/H3N2, B và virút cúm A/H5N1 lưu hành trong giai đoạn 2001-2009. 3 Chương 1 TỔNG QUAN 1. Đặc điểm chung Virút cúm thuộc họ Orthomyxoviridae, bao gồm 5 nhóm virút: virút cúm A, virút cúm B, virút cúm C, virút Thogoto và virút Isa.

Trong đó, virút cúm A lưu hành phổ biến trên gia cầm, người và các động vật khác như lợn, ngựa., là căn nguyên gây nên các đại dịch lớn trên toàn cầu. Virút cúm B và C chỉ lưu hành chủ yếu ở người và thường chỉ gây nên các vụ dịch vừa và nhỏ. Virút cúm A được chia thành các phân týp dựa vào cấu trúc kháng nguyên bề mặt là HA (haemagglutinin) và NA (neuraminidase). Kháng nguyên HA được biết đến với 16 phân týp khác nhau từ H1 đến H16, kháng nguyên NA được chia thành 9 phân týp khác nhau từ N1 đến N9.