Luận án Tiến sĩ: Tiêu chuẩn hóa & Tác dụng sinh học Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis)

BỘ GÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH DƢƠNG HỒNG TỐ QUYÊN NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA SÂM VIỆT NAM (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV., ARALIACEAE) LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC TP. HỒ CHÍ MINH, Năm 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH DƢƠNG HỒNG TỐ QUYÊN NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA SÂM VIỆT NAM (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV., ARALIACEAE) NGÀNH: DƢỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 62720406 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. NGUYỄN MINH ĐỨC 2. NGUYỄN THỊ THU HƢƠNG TP.HỒ CHÍ MINH, Năm 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chƣa từng đƣợc công bố ở bất kỳ nơi nào.

Tác giả luận án i MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT. ii DANH MỤC CÁC ẢNG. iv DANH MỤC CÁC H NH. vii MỞ ĐẦU.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU. TỔNG QUAN VỀ CHI PANAX. SÂM VIỆT NAM. NGHIÊN CỨU VỀ TIÊU CHUẨN HÓA SÂM VIỆT NAM.

ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.

XÂY DỰNG VÀ ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI MỘT SỐ SAPONIN TRONG SÂM VIỆT NAM TRỒNG. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN SÂM VIỆT NAM TRỒNG. ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA SÂM VIỆT NAM TRỒNG 6 TUỔI. XÂY DỰNG VÀ ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI MỘT SỐ SAPONIN TRONG SÂM VIỆT NAM TRỒNG.

XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN SÂM VIỆT NAM TRỒNG. ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA SÂM VIỆT NAM TRỒNG 6 TUỔI.137 DANH MỤC CÁC C NG TR NH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN. TÀI LIỆU THAM KHẢO. ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ đầy đủ Nghĩa tiếng việt ADN Acid deoxyribonucleic AST Aspartate aminotransferase ALT Alanine aminotransferase AF Asymetric factor Hệ số bất đối AAPH (2,2‟- azobis (2- amidinopropane hydrochloride)) CC Column Chromatography Sắc ký cột CHCl3 Cloroform CCl4 Carbon tetrachlorid CY Cyclophosphamide Cyclophosphamid CS.

Cộng sự DCF-DA 2‟,7‟- dichlorodihydrofluorescein - diacetat DĐVN Dƣợc điển Việt Nam DAD Diode Array Detector Detector dãy diốt quang EC50 Effective Concentration 50% Nồng độ kháng oxy hóa 50% FST Forced swimming test Thực nghiệm bơi bắt buộc G- Ginsenoside Ginsenosid GABA Gamma-aminobutyric acid Acid aminobutyric GSH Glutathione Glutathion HPLC High Perfomance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1- Acid (4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid) piperazineethanesulfonic) iii Từ viết tắt Từ đầy đủ Nghĩa tiếng việt I.P Intraperitoneally Tiêm phúc mô LD50 Lethal dose 50% Liều chết 50% MDA Malonyl dialdehyde Malonyl dialdehyd M- Majonoside Saponin majonosid MS Mass Spectroscopy Phổ khối NO Nitrogen oxide NS Nhân sâm OD Optical Density Mật độ quang OCT Ocotillol Saponin nhóm ocotillol P. Panax Chi Panax Q-TOF-MS Quadrupole Time of Flight Máy đo phổ khối tứ cực – thời Mass Spectrometer gian bay ROS Reactive Oxygen Species Gốc tự do oxy hóa Rt Retention time Thời gian lƣu SKĐ Sắc ký đồ SKLM Sắc ký lớp mỏng Sâm VN Sâm Việt Nam Sâm Việt Nam trồng Sâm VN-MH Sâm Việt Nam mọc hoang TBA Thiobarbituric acid Acid thiobarbituric TST Tail suspension test Thực nghiệm treo đuôi chuột TNF Tumor necrosis factor Yếu tố hoại tử khối u iv DANH MỤC CÁC ẢNG Bảng 1. Các loài sâm đƣợc chấp nhận thuộc chi Panax. Chỉ tiêu kiểm nghiệm vài loài sâm theo chuyên luận Dƣợc điển.

Thành phần saponin trong Sâm Việt Nam. Một số tác dụng dƣợc lý khác của Sâm Việt Nam. Cách pha dung dịch đƣờng chuẩn. Nồng độ các giai mẫu mẫu xây dựng đƣờng tuyến tính HPLC-DAD.

Thông số của detector phổ khối áp dụng định lƣợng saponin. Kết quả HPLC-MS nhận dạng ion của 5 saponin đối chiếu. Hàm lƣợng saponin chiết bằng siêu âm và chiết lắc. Saponin chiết với methanol tại 3 nồng độ định lƣợng bằng HPLC-MS 61 Bảng 3.

Hàm lƣợng saponin chiết tại 3 nhiệt độ định lƣợng bằng HPLC-MS. Hàm lƣợng saponin chiết tại 3 thời gian định lƣợng bằng HPLC-MS. Tính tƣơng thích của hệ thống HPLC-MS định lƣợng saponin. Thời gian lƣu của 5 saponin trên HPLC-MS sau 6 lần tiêm mẫu.

Dữ liệu xác nhận khối lƣợng ion của một số saponin chuẩn. Kết quả phƣơng trình tính tuyến tính. Độ lặp lại trong ngày của phƣơng pháp HPLC-MS. Độ lặp lại liên ngày của phƣơng pháp HPLC-MS.

Kết quả độ đúng trong định lƣợng G-Rg1 bằng HPLC-MS. Kết quả độ đúng trong định lƣợng M-R2 bằng HPLC-MS. Độ đúng của phƣơng pháp định lƣợng V-R2 bằng HPLC-MS. Kết quả độ đúng định lƣợng G-Rb1 bằng HPLC-MS.

Kết quả độ đúng của phƣơng pháp định lƣợng G-Rd bằng HPLC-MS 68 Bảng 3. Giới hạn phát hiện và định lƣợng 5 saponin bằng HPLC-MS. Hàm lƣợng saponin trong Sâm Việt Nam trồng 2 - 6 tuổi. Hàm lƣợng 4 saponin chiết xuất bằng MeOH với hàm lƣợng khác nhau.

Hàm lƣợng 4 saponin chiết tại mức nhiệt độ khác nhau. Hàm lƣợng saponin theo thời gian chiết xuất. Hàm lƣợng 4 saponin từ số lần chiết xuất khác nhau. Giá trị các thông số sắc ký ứng với pic G-Rg1 trong mẫu chuẩn.

Giá trị các thông số sắc ký ứng với pic M-R2 trong mẫu chuẩn. Giá trị các thông số sắc ký ứng với pic G-Rb1 trong mẫu chuẩn. Giá trị các thông số sắc ký ứng với pic G-Rd trong mẫu chuẩn. Diện tích pic tƣơng ứng với các nồng độ của mẫu đối chiếu.

Phƣơng trình hồi quy của chất chuẩn G-Rg1, G-Rb1, G-Rd, M-R2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng bằng HPLC-DAD. Độ lặp lại trong ngày của phƣơng pháp HPLC-DAD. Kết quả độ lặp liên ngày của phƣơng pháp HPLC-DAD.

Kết quả độ đúng của phƣơng pháp HPLC-DAD định lƣợng G-Rg1. Kết quả độ đúng của phƣơng pháp HPLC-DAD định lƣợng M-R2. Kết quả độ đúng của phƣơng pháp HPLC-DAD định lƣợng G-Rb1. Kết quả độ đúng của phƣơng pháp HPLC-DAD định lƣợng G-Rd.

Kết quả hàm lƣợng một số saponin trong Sâm Việt Nam trồng. Khối lƣợng cao toàn phần và saponin toàn phần. Độ đúng của quy trình định lƣợng saponin trong cao Sâm VN. Hàm lƣợng 5 saponin trong cao Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi.

Thời gian bơi tuyệt đối các nhóm chuột thử nghiệm Brekhman. Thời gian bơi tƣơng đối các nhóm chuột trên thực nghiệm Brekhman. Thời gian bơi tuyệt đối của thử nghiệm bơi điều chỉnh tốc độ dòng. Thời gian bơi tƣơng đối trên thực nghiệm bơi điều chỉnh tốc độ dòng.

Hoạt tính kháng oxy hóa trên tế bào Hep G2. Hoạt độ AST, ALT trong huyết tƣơng trên thực nghiệm CCl4. Hàm lƣợng MDA, GSH trong gan chuột trên thực nghiệm CCl4. Hàm lƣợng MDA và GSH trong gan chuột trên thực nghiệm CY.

Sự thay đổi trọng lƣợng cơ thể của các lô chuột trong thử nghiệm. Hoạt độ AST, ALT trong huyết tƣơng trên thực nghiệm ethanol. Kết quả hàm lƣợng MDA, GSH trong gan chuột vào tuần 8. Tiềm thời và thời gian ngủ của các lô chuột sau các tuần thí nghiệm.

Tác dụng cao Sâm Việt Nam trên tiềm thời và thời gian ngủ. Thời gian ra sáng và số lần ra sáng của các lô chuột liều duy nhất. Thời gian ở sáng và số lần ra sáng điều trị sau 7 ngày. Thời gian bất động của các lô chuột thí nghiệm liều duy nhất.

Thời gian bất động các lô chuột điều trị liều sau 7 và 14 ngày. Thời gian ra ngăn sáng và số lần ra ngăn sáng trên thực nghiệm sáng tối. Thời gian bất động của chuột trên thực nghiệm FST và TST. Hàm lƣợng MDA, GSH tế bào não chuột trầm cảm do cô lập.

So sánh tác dụng dƣợc lý Sâm VN với Nhân Sâm và Sâm VN-MH .132 vii DANH MỤC CÁC H NH Hình 1. Khung cơ bản của các saponin thuộc chi Panax. Bộ phận trên mặt đất (A) và bộ phận dƣới mặt đất của Sâm Việt Nam (B). SKĐ thăm dò chƣơng trình pha động điều kiện 1.

SKĐ tổng ion (TIC) từ 5 saponin đối chiếu của HPLC-MS. SKĐ extract ion (EIC) của từng saponin đối chiếu trên HPLC-MS. Phổ MS của 5 saponin đối chiếu. Phổ MS của 5 saponin đối chiếu sau khi lần lƣợt cắt phân tử đƣờng.

SKĐ của mẫu thử tại điều kiện 3. SKĐ độ tinh khiết của 4 saponin trong hỗn hợp mẫu đối chiếu. SKĐ độ tinh khiết pic của 4 saponin định lƣợng trong mẫu thử. SKĐ mẫu trắng .12 SKĐ mẫu đối chiếu của 4 saponin.

SKĐ của 4 saponin định lƣợng trong mẫu thử. SKĐ của mẫu thử thêm 4 saponin của mẫu đối chiếu. Bộ phận dƣới mặt đất của Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi .Vi phẫu thân rễ Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi. Vi phẫu rễ củ Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi.

Đặc điểm bột thân rễ và rễ củ của Sâm Việt Nam. Sắc ký lớp mỏng mẫu Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi. SKĐ cao toàn phần Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi .88 1 MỞ ĐẦU Sâm Việt Nam (còn gọi là Sâm Ngọc linh, Sâm Khu 5, Sâm Đốt Trúc) đƣợc tìm thấy ở vùng núi Ngọc Linh tỉnh Kon Tum vào năm 1973. Đến năm 1985, đƣợc xác định tên khoa học là Panax vietnamensis Ha et Grushv., họ Nhân sâm (Araliaceae) [3].

Hiện nay, Sâm Việt Nam cũng đƣợc lựa chọn là cây thuốc hàng đầu trong danh mục sản phẩm quốc gia. Năm 2011, Bộ Y Tế đã triển khai xây dựng đề án: “Chƣơng trình quốc gia bảo tồn, phát triển nguồn dƣợc liệu trong nƣớc và các sản phẩm từ dƣợc liệu giai đoạn từ nay đến năm 2020 và tầm nhìn đến 2030. Xây dựng hồ sơ 40 dƣợc liệu có tiềm năng khai thác và phát triển thị trƣờng”. Trong đó cây Sâm Việt Nam đƣợc chọn đứng vị trí đầu tiên trong danh sách.

Bên cạnh đó, theo Quyết định số 787/QĐ/TTg ngày 05/6/2017 của Thủ tƣớng chính phủ, Sâm Việt Nam là sản phẩm thuộc chƣơng trình phát triển sản phẩm quốc gia đến năm 2020. Sâm Việt Nam đƣợc thế giới biết đến nhƣ là một loài Sâm mới và có giá trị cao nhƣ Nhân Sâm. Hiện nay, Sâm Việt Nam đƣợc trồng tại một số vùng đặc hữu nhƣ Kon Tum và Quảng Nam. Trên thị trƣờng, Sâm Việt Nam thƣờng bị giả mạo bởi những dƣợc liệu khác, nhiều trƣờng hợp không những không có tác dụng điều trị mà còn có thể gây độc hại cho ngƣời dùng.

Vì vậy việc kiểm nghiệm đánh giá chất lƣợng Sâm Việt Nam là cần thiết. Bên cạnh đó, sự phát hiện một thứ của cây Sâm Việt Nam là Panax vietnamensis var.