Luận án: Đa dạng xạ khuẩn nội sinh cây quế Việt Nam, sinh kháng sinh và hoạt chất

viÖn HÀN LÂM khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam ViÖn c«ng nghÖ sinh häc VŨ THỊ HẠNH NGUYÊN NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG, KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY QUẾ (Cinnamomum cassia Presl) Ở VIỆT NAM VÀ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA HOẠT CHẤT TỪ CHỦNG Streptomyces cavourensis YBQ59 LuËn ¸n tiÕn sÜ sinh häc Hà Nội, năm 2019 i VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VŨ THỊ HẠNH NGUYÊN NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG, KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY QUẾ (Cinnamomum cassia Presl) Ở VIỆT NAM VÀ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA HOẠT CHẤT TỪ CHỦNG Streptomyces cavourensis YBQ59 Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9 42 01 07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. Phí Quyết Tiến Viện Công nghệ sinh học 2. Chu Kỳ Sơn Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Hà Nội, năm 2019 ii LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS. Phí Quyết Tiến, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và PGS.

Chu Kỳ Sơn, Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện tốt nhất về cơ sở vật chất giúp tôi thực hiện và hoàn thành luận án này. Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS. Vũ Thu Trang, TS.

Khiếu Thị Nhàn Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã giúp đỡ, hợp tác nghiên cứu đề tài luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. Lê Gia Hy và các cán bộ phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ, hỗ trợ kỹ thuật, chia sẻ tài liệu, kinh nghiệm với tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi xin gửi lời cám ơn PGS.TS Nguyễn Tiến Đạt và các cán bộ phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hóa sinh biển đã giúp đỡ, hợp tác trong nghiên cứu và hỗ trợ các trang thiết bị kỹ thuật tốt nhất để tôi thực hiện thành công các nghiên cứu thực nghiệm.

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Bùi Thị Hải Hà, chuyên viên phụ trách đào tạo, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành mọi thủ tục trong suốt quá trình học tập làm nghiên cứu sinh tại Viện. Cuối cùng tôi xin cảm ơn bạn bè và gia đình đã luôn bên tôi, cổ vũ và động viên tôi những lúc khó khăn để hoàn thành tốt luận án này. Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2019 NCS.

Vũ Thị Hạnh Nguyên i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác; Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả NCS. Vũ Thị Hạnh Nguyên ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN. i LỜI CAM ĐOAN.

ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT. xi MỞ ĐẦU. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Tổng quan về xạ khuẩn nội sinh trên thực vật và cây dược liệu.

Giới thiệu về vi sinh vật và xạ khuẩn nội sinh. Tương tác giữa xạ khuẩn nội sinh và thực vật. Ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh trong công nghệ sinh học và y dược. Phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu.

Đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu. Đa dạng xạ khuẩn nội sinh trong các mô thực vật. Đa dạng di truyền của xạ khuẩn nội sinh. Đánh giá đa dạng sinh học của xạ khuẩn theo sản phẩm trao đổi chất thứ cấp.

Sinh tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh và một số nghiên cứu về loài Streptomyces cavourensis. Chất kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu. Các gen mã hóa enzyme tham gia quá trình tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn. Nghiên cứu đặc tính và xác định cấu trúc kháng sinh.

Một số cấu trúc kháng sinh sinh tổng hợp bởi xạ khuẩn. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh. Một số nghiên cứu về xạ khuẩn Streptomyces cavourensis. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh tại Việt Nam và tiềm năng khai thác xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (Cinnamomum cassia Presl).

Tình hình nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh ở Việt Nam. Đặc điểm của cây quế (Cinnamomum sp. Tiềm năng phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (Cinnamomum sp. 34 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

Vật liệu nghiên cứu. Mẫu nghiên cứu, chủng giống vi sinh vật và các dòng tế bào ung thư. Hóa chất và thiết bị. Môi trường nuôi cấy.

Phương pháp nghiên cứu. Xác định thành phần và số lượng vi sinh vật trong mẫu quế. Xác định khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ khuẩn nội sinh. Phân loại các chủng xạ khuẩn dựa trên phân tích trình tự gen 16S rDNA.

Xác định đặc điểm sinh học của xạ khuẩn. Tách chiết, giải trình tự và phân tích hệ gen của chủng xạ khuẩn YBQ59. Lựa chọn môi trường và điều kiện lên men thích hợp cho xạ khuẩn. Tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc các chất kháng khuẩn của chủng xạ khuẩn.

Xử lý thống kê. 47 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. Đa dạng và khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C. Phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C.

Đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C. Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của xạ khuẩn nội sinh. Phân tích trình tự gen 16S rDNA của xạ khuẩn nội sinh sinh kháng sinh. Khuếch đại gen mã hóa polyketide synthases (PKS-I, PKS-II) và nonribosomal peptide synthetase (NRPS) tham gia sinh tổng hợp kháng sinh.

Khả năng sinh chất kháng sinh thuộc nhóm anthracycline. Đặc điểm sinh học và điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh kháng sinh của chủng Streptomyces cavourensis YBQ59. Đặc điểm sinh học của chủng S. Đặc điểm di truyền và một số gen liên quan đến sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S.

Lựa chọn môi trường thích hợp sinh kháng sinh của chủng S. Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến khả năng sinh kháng sinh. Ảnh hưởng điều kiện lên men đến sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S. Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng S.

Hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào ung thư của chủng S. Tách chiết, tinh sạch và đặc tính của các hoạt chất thứ cấp từ chủng S. Tách chiết và tinh sạch các hoạt chất thứ cấp. Hoạt tính sinh học của các hợp chất tách được từ chủng S.

83 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ. Đa dạng và khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C. Đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C. Khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ khuẩn nội sinh.

Phân tích trình tự gen 16S rDNA của xạ khuẩn nội sinh kháng sinh. Đặc điểm sinh học và điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh kháng sinh của chủng S. Đặc điểm sinh học của chủng S. Đặc điểm di truyền và một số gen liên quan đến sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S.

Lựa chọn môi trường và điều kiện nuôi cấy sinh kháng sinh của chủng S. Tách chiết, tinh sạch và đặc tính của các hoạt chất thứ cấp từ chủng S. 102 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 114 NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ.

116 LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI. 116 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 125 vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Tổng hợp một số nghiên cứu trên thế giới về đa dạng sinh học của xạ khuẩn nội sinh trên thực vật và cây dược liệu.

Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu. Các chất chuyển hóa được sinh tổng hợp bởi xạ khuẩn được sử dụng trong y học với các cơ chế sinh tổng hợp. Số liệu thống kê hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của 297 chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ cây quế. Kết quả phân loại các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế Hòa Bình, Lai Châu và Yên Bái dựa trên kết quả phân tích trình tự gen 16S rRNA.

Sự phân bố của các chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ cây quế. So sánh đặc điểm phân loại của chủng Streptomyces cavourensis YBQ59 với các chủng S. cavourensis với các chủng tham chiếu. Khả năng đồng hóa nguồn nitơ của chủng S.

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của chủng S. Hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thư của từ dịch lên men của chủng YBQ59. Tổng hợp các hợp chất thứ cấp phân lập từ chủng S. Hoạt tính kháng khuẩn các hợp chất tinh sạch từ chủng S.

Hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thư của các chất tách được từ chủng S. 85 vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1. Quá trình xâm nhập vào lỗ khí và gian bào của S. galbus MBR-5 trên lá đỗ quyên sau 60 ngày quan sát.

Cấu trúc hóa học của một số kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh (1-6). Sơ đồ mô tả hình thành chuỗn polyketide bởi synthase gồm bốn mô đun riêng biệt. synthase bao gồm một protein đa mô đun đơn được mã hóa bởi một gen duy nhất chứa bốn mô đun enzyme, đặc trưng của loại PKS- I. Mỗi mô đun có mặt trên một protein của loại PKS-II.

Sơ đồ mô tả hình thành chuỗn peptide gồm 4 mô đun và được mã hóa bởi hai gen khác nhau. Sản phẩm tạo ra là tetrapeptide. Cấu trúc của một số kháng sinh điển hình thuộc nhóm anthracycline DOX, DNR, EPI và IDA. Một số bộ phận của cây quế đơn (C.

Khuẩn lạc các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C. cassia Presl) tại Hòa Bình (A), Lai Châu (B) và Yên Bái (C) phân lập trên một số môi trường đặc hiệu sau 4-6 tuần nuôi cấy. Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh trên các bộ phận của cây quế (C.