Luận án tiến sĩ: Phát hiện đột biến gen và đối chiếu kiểu gen - kiểu hình bệnh nhi Thalassemia tại BV Trẻ em Hải Phòng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y-DƯỢC HẢI PHÒNG ĐỖ THỊ QUỲNH MAI PHÁT HIỆN MỘT SỐ ĐỘT BIẾN GEN VÀ ĐỐI CHIẾU KIỂU GEN VỚI KIỂU HÌNH CỦA BỆNH NHI THALASSEMIA TẠI BỆNH VIỆN TRẺ EM HẢI PHÒNG LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC Chuyên ngành : Nhi Mã số : 97.106 Người hướng dẫn khoa học: PGS. NGUYỄN NGỌC SÁNG TS. BẠCH THỊ NHƯ QUỲNH HẢI PHÒNG - 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi là Đỗ Thị Quỳnh Mai, nghiên cứu sinh khóa 3 Trường Đại học Y Dược Hải Phòng, chuyên ngành Nhi, xin cam đoan: 1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của: PGS.

Nguyễn Ngọc Sáng và TS. Bạch Thị Như Quỳnh 2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam. Các số liệu và thông tin nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này. Hải Phòng, ngày 08 tháng 11 năm 2022 Đỗ Thị Quỳnh Mai LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, trước hết tôi xin bày tỏ lòng kính trọng, sự biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Ngọc Sáng và TS Bạch Thị Như Quỳnh, những người thầy đã tận tụy dạy dỗ, chỉ bảo và hết lòng hướng dẫn giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết Đảng uỷ, Ban Giám hiệu Trường Đại học Y Dược Hải Phòng, các Thầy, các Cô của Bộ môn Nhi, các Thầy, Cô và các cán bộ, nhân viên Phòng quản lý Đào tạo Sau Đại học, Trường Đại học Y Dược Hải Phòng đã dành mọi sự thuận lợi, giúp đỡ tận tình và dành cho tôi sự động viên quý giá trong quá trình học tập và nghiên cứu và hoàn thành luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn Ban Giám đốc, phòng Kế hoạch Tổng hợp, các Thầy, Cô, các cán bộ, nhân viên khoa Thận – Máu – Nội tiết, Khoa Sinh hóa, Huyết học và các phòng, ban của Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng đã nhiệt tình tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với các Giáo sư, Phó giáo sư, Tiến sỹ, các thầy, cô là thành viên Hội đồng bảo vệ luận án cấp Bộ môn, cấp Trường, đã cho tôi những ý kiến góp ý và chỉ bảo quý báu để tôi hoàn thiện luận án. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới gia đình bao gồm cha và mẹ, những người đã có công sinh thành, chồng và các con thân yêu của tôi đã động viên tôi rất nhiều, các anh chị em và bạn bè đồng nghiệp cũng đã chia sẻ, giúp đỡ, động viên và giành cho tôi rất nhiều tình cảm trong quá tình làm việc, học tập và nghiên cứu. Hải Phòng, ngày 08 tháng 11 năm 2022 Đỗ Thị Quỳnh Mai DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT A Adenosine ARMS-PCR Amplification Refractory Mutation System – Polymerase Chain Reaction (Hệ thống khuyếch đại đột biến trơ - Phản ứng chuỗi polymerase) ASO Allele-specific Oligonucleotide (Oligonucleotide đặc trưng alen) β0 Không tổng hợp chuỗi Beta β+ Giảm tổng hợp chuỗi Beta β++ Giảm nhẹ tổng hợp chuỗi Beta BC Bạch cầu BVTEHP Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng C Cytidine CS Cộng sự DNA Desoxyribonucleic acid ĐBG Đột biến gen G Guanin GAP-PCR GAP-Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase cách đoạn) Hb Hemoglobin HBA Gen quy định tổng hợp chuỗi alpha globin HBB Gen quy định tổng hợp chuỗi beta globin HC Hồng cầu HbE Hemoglobin E HbF Hemoglobin Fetal HbCs Hemoglobin Constant Spring IVS Intervening sequence (Trình tự chèn hay Intron) LIC Liver iron concentration (Nồng độ sắt trong gan) mRNA message Ribonucleotic acid (RNA thông tin) MCH Mean Corpuscular Hemoglobin (Lượng huyết sắc tố trung bình hồng cầu) MCHC Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration (Nồng độ hemoglobin trung bình hồng cầu) MCV Mean Corpuscular Volume (Thể tích trung bình hồng cầu) MLPA Multiplex Ligationdependent Probe Amplification (Khuếch đại đa đoạn dò) NST Nhiễm sắc thể PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng khuyếch đại chuỗi) RNA RNA: Ribonucleic acid TIF Thalassemia Intermedia Federation (Liên đoàn Thalassemia quốc tế) T Thymidine TC Tiểu cầu TVDT Tư vấn di truyền 3’ UTR 3’ Untranscriptional Region (Vùng 3’ không sao mã) 5’ UTR 5’ Untranscriptional Region (Vùng 5’ không sao mã) MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ. 1 Chương 1: TỔNG QUAN.

Đặc điểm dịch tễ học bệnh Thalassemia. Đặc điểm lâm sàng và xét nghiệm. Tổng quan phương pháp lập và phân tích phả hệ bệnh Thalassemia. 28 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu. 35 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. Đột biến gen gây bệnh Thalassemia ở bệnh nhi tại Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng.

Đối chiếu kiểu gen với kiểu hình của các bệnh nhi Thalassemia ở Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng. Mô tả đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng theo gen đột biến và bước đầu xây dựng 1 số phả hệ. 67 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN. Xác định đột biến gen gây bệnh Thalassemia ở bệnh nhi tại Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng.

Đối chiếu kiểu gen với kiểu hình của các bệnh nhi Thalassemia ở Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng. Error! Bookmark not defined. Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng theo gen đột biến và bước đầu xây dựng 1 số phả hệ. 113 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN.

115 NHỮNG HẠN CHẾ CỦA ĐỀ TÀI. 117 PHƯƠNG HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO. 117 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 118 DANH SÁCH BỆNH NHÂN.

136 DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1. Tỷ lệ người mang gen Thalassemia tại Việt Nam. Đột biến trên gen Hb (tổng hợp từ nhiều nghiên cứu). Tỉ lệ người mang gen ở nước ta (tổng hợp từ nhiều nghiên cứu).

Cấu trúc globin của Hb sinh lý. Các loại allen đột biến của bệnh α-Thalassemia. Các đột biến gây bệnh β-Thalassemia. Các kiểu gen và kiểu hình của bệnh α-Thalassemia.

Trình tự mồi và kích thước của 5 đột biến thường gặp. Các thông số của phản ứng GAP-PCR của 5 đột biến thường gặp .3 Trình tự mồi và kích thước của 2 đột biến điểm thường gặp. Các thông số của phản ứng ARMS-PCR. Đặc điểm về tuổi vào viện và tuổi phát hiện bệnh.

Phân bố bệnh nhi α và β-Thalassemia theo nhóm tuổi vào viện. Phân bố bệnh nhân theo tuổi phát hiện bệnh. Đặc điểm về giới của đối tượng nghiên cứu. Đặc điểm về địa dư của đối tượng nghiên cứu.

Phân bố đột biến gen hemoglobin ở bệnh nhân α-Thalassemia. Phân loại bệnh nhân α-Thalassemia theo kiểu đột biến gen. Phân bố đột biến gen β-globin ở bệnh nhân β-Thalassemia. Phân loại đột biến β-globin theo vị trí gen bị đột biến.

Phân bố bệnh nhân β-Thalassemia theo chức năng gen bị đột biến. Phân bố bệnh nhân β-Thalassemia theo kiểu gen đột biến. Phân bố đối tượng nghiên cứu theo lý do vào viện. Phân bố đối tượng nghiên cứu theo triệu chứng lâm sàng khi vào viện.

Phân bố đối tượng nghiên cứu theo mức độ lách to khi vào viện. Phân bố đối tượng nghiên cứu theo triệu chứng bộ mặt Thalassemia. Đặc điểm niêm mạc lợi của đối tượng nghiên cứu khi vào viện. Phân bố bệnh nhân theo tuổi bắt đầu truyền máu.

Phân bố bệnh nhân theo số lần truyền máu mỗi năm. Đặc điểm lệ thuộc truyền máu của bệnh nhân Thalassemia. Đặc điểm huyết học của đối tượng nghiên cứu. Đặc điểm sắt và ferritin huyết thanh ở bệnh nhân Thalassemia.

Đặc điểm GOT, GPT, ure, creatinin ở bệnh nhân Thalassemia. Hội chứng tán huyết theo gen đột biến α-Thalassemia. Đặc điểm lâm sàng theo gen đột biến α-Thalassemia. Đặc điểm huyết học theo số lượng gen đột biến α-Thalassemia (n=27).

Đặc điểm điện di huyết sắc tố theo số lượng gen đột biến. Đặc điểm lâm sàng theo đột biến gen HBB ở β-Thalassemia. Đặc điểm huyết học theo đột biến gen HBB ở β-Thalassemia. Đặc điểm điện di HST theo đột biến gen HBB của β-Thalassemia.

71 DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1. Gen α và β globin (trên nhiễm sắc thể 16 và 11). Phân bố đối tượng nghiên cứu theo kiểu hình bệnh (n=83). Hình ảnh điện di thu được của đột biến SEA, 3.

Hình ảnh điện di thu được của đột biến c2delT. Hình ảnh điện di thu được của đột biến HbCs. Phân loại bệnh nhân α-Thalassemia theo số lượng gen đột biến (n=27). Hình ảnh điện di thu được của đột biến CD17, CD41/42.

Hình ảnh điện di thu được của đột biến CD95. Hình ảnh điện di thu được của đột biến CD26. Hình ảnh điện di thu được của đột biến CD71/72. Hình ảnh điện di đột biến IVS1.

Phả hệ gia đình số 1. Phả hệ gia đình số 2. Phả hệ gia đình số 3. Phả hệ gia đình số 4.

Phả hệ gia đình số 5. Phả hệ gia đình số 6. Phả hệ gia đình số 7. Phả hệ gia đình số 8.

Phả hệ gia đình số 9. Phả hệ gia đình số 10. Phả hệ gia đình số 11. Phả hệ gia đình số 12.

Kết quả phát hiện đột biến CD95 ở gia đình phả hệ số 11. 108 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Thalassemia là một nhóm bệnh thiếu máu tan máu bẩm sinh do đột biến gen globin gây nên thiếu hụt tổng hợp một phần hay toàn bộ mạch polypeptid trong globin của hemoglobin. Các thể bệnh Thalassemia được mô tả và đặt tên dựa theo chuỗi globin bị ảnh hưởng, thường gặp nhất trong lâm sàng là α- Thalassemia, β-Thalassemia hay δβ-Thalassemia [1], [2]. Liên đoàn Thalassemia thế giới ước tính hiện có khoảng 7% dân số thế giới mang gen bệnh.

Hàng năm có 300 đến 400 nghìn đứa trẻ sinh ra bị thiếu máu do mắc căn bệnh này. Bệnh ảnh hưởng đến hầu hết các quốc gia, nhưng có sự khác biệt đáng kể ngay cả trong các khu vực địa lý nhỏ [3]. Trước đây, bệnh phổ biến ở khu vực Địa Trung Hải, Trung Đông và Đông Nam Á. Tuy nhiên, bệnh đang có xu hướng gia tăng ở các khu vực khác, bao gồm cả Bắc Âu và Bắc Mỹ, chủ yếu do di cư [4].

Việt Nam nằm trong “vành đai Thalassemia”. Theo thống kê, nước ta đang là một trong những quốc gia có tỷ lệ người mắc bệnh Thalassemia cao nhất thế giới. Hội tan máu bẩm sinh Việt Nam (VITA) năm 2014 ước tính có khoảng 10 triệu người mang gen bệnh Thalassemia, bao gồm khoảng 20.