Luận án tiến sĩ sinh học: Phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh Bacillus anthracis và Yersinia pestis - Đinh Thị Thu Hằng, Học viện Quân y

LỜI CẢM ƠN Trên con đường khoa học đầy vinh quang nhưng cũng không ít những chông gai và hoàn thành luận án này mới chỉ là bước khởi đầu, tôi thấy mình thật may mắn bởi luôn có những người thầy, cộng sự, người thân đã đồng hành cùng tôi. Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tới PGS. Nguyễn Thái Sơn và PGS. Nghiêm Ngọc Minh, những người thầy luôn tận tụy, góp ý cho tôi, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án.

Luận án được thực hiện tại Bộ môn Vi sinh y học; Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y và Phòng Công nghệ sinh học môi trường, Viện Công nghệ sinh học, với sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô, anh chị em đồng nghiệp giành cho, tôi xin phép được gửi tới lòng biết ơn chân thành nhất. Luận án nhận được sự hỗ trợ quý báu bởi đề tài cấp Bộ Quốc Phòng “Nghiên cứu chế tạo kit PCR đa mồi xác định nhanh đồng thời hai tác nhân vi khuẩn than và dịch hạch”, do PGS. Nguyễn Thái Sơn làm chủ nhiệm. Đồng thời, để có thể hoàn thành được chương trình học tập cũng như hoàn thành luận án, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu và nhiệt tình của các cá nhân và cơ quan, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến: GS.

Trương Nam Hải, nguyên Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học đã dành cho tôi những đóng góp quý báu về nội dung nghiên cứu chính giai đoạn đầu của nghiên cứu sinh cùng những quan tâm, động viên giúp tôi hoàn thành luận án. Ban Lãnh đạo, Bộ phận Đào tạo Viện Công nghệ sinh học; Đảng ủy, Ban Giám đốc Học viện Quân y; Ban Cán bộ, Phòng Chính trị; Chỉ huy Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự đã tạo điều kiện về thời gian, kinh phí và trang thiết bị. Đoàn Trọng Tuyên, Cục Quân y đã tạo điều kiện thuận lợi về chủng nghiên cứu cùng những chia sẻ về kiến thức, kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu với các mầm bệnh nguy hiểm. Cuối cùng là gia đình thân yêu và bạn bè đã luôn tin tưởng, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện thành công luận án này.

Đinh Thị Thu Hằng i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 NCS.

Đinh Thị Thu Hằng ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ Giải nghĩa API Analytical profile index BHI Brain heart infusion Môi trường dinh dưỡng BHI BLAST Basic local alignment search tool Công cụ tìm kiếm sắp xếp cơ bản Bp Base pairs Cặp base BSL-3 Bio-safety level 3 An toàn sinh học cấp 3 CDC Centers for Disease Control and Trung tâm kiểm soát và phòng Prevention ngừa dịch bệnh CFU Colony forming unit Đơn vị hình thành khuẩn lạc CRMs Certified reference materials Vật liệu tham chiếu được chứng nhận dNTPs Deoxynucleotide triphosphates EQA External quality assessment Đánh giá chất lượng từ bên ngoài IC Internal amplification control Chứng nội tại ID Identification Định danh IS International standard Mẫu chuẩn quốc tế ISO International standard Tổ chức Tiêu chuẩn Quốc tế organization Kb Kilo base LAMP Loop mediated isothermal Khuếch đại đẳng nhiệt tạo vòm amplification LB Luria-Bertani MCS Multiplex cloning site Vùng đa điểm cắt iii mPCR Multiplex PCR PCR đa mồi NAT Nucleic acid amplification Xét nghiệm khuếch đại dựa trên testing axit nucleic NCBI The National Center for Trung tâm Quốc gia về thông tin Biotechnology Information công nghệ sinh học NGS Next generation sequencing Giải trình tự thế hệ mới NIBSC The National Institute for Viện Quốc gia về kiểm chuẩn Biological Standards and Control sinh học NIST The National Institute of Viện Quốc gia về Tiêu chuẩn và Standards and Technology Công nghệ OD Optical density Mật độ quang học ORF Open reading frame Khung đọc mở PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp QA Quality assurance Đảm bảo chất lượng QC Quality control Kiểm soát chất lượng RMs Reference materials Các vật liệu tham chiếu Rpm Resolution per minute Vòng/phút SNPs Single nucleotide Đa hình nucleotide đơn polymorphisms SRMs Standard Reference Materials Các vật liệu tham chiếu chuẩn TBE Tris - Borate - EDTA YHDPQĐ Y học dự phòng Quân đội WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới iv DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1. Đặc điểm hệ gen của chủng B. Thông tin các chủng vi khuẩn nghiên cứu. Các mồi sử dụng trong nghiên cứu nhân dòng và giải trình tự.

Trình tự cặp mồi tạo dòng chứng nội tại cạnh tranh. Các máy và thiết bị chính. Thành phần dự kiến của mPCR xác định đồng thời B. Thông tin 6 cặp mồi của mPCR xác định B.

Tổng hợp kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi trong mPCR. Tổng hợp kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 trong mPCR. Tổng hợp kết quả tối ưu nồng độ dNTPs trong mPCR. Tổng hợp kết quả tối ưu dung dịch đệm trong mPCR.6 Các thành phần cho mPCR tối ưu với 6 cặp mồi xác định gen vrrA, pagA, capA, ypo2088, pla, caf1 phát hiện đồng thời B.

Bảng pha loãng DNA xác định ngưỡng phát hiện B. Bộ mẫu chuẩn độ nhạy mPCR xác định B. Bảng pha loãng DNA xác định ngưỡng phát hiện Y. Bộ mẫu chuẩn độ đặc hiệu kiểm định kit B.

Đánh giá độ nhạy của mPCR với B. anthracis trên bộ mẫu chuẩn. Đánh giá độ nhạy của bộ kit mPCR với Y. pestis trên bộ mẫu chuẩn.

Đánh giá độ đặc hiệu của bộ kit mPCR với B. Đánh giá độ đặc hiệu của kit mPCR với Y. pestis trên bộ mẫu chuẩn. Tổng hợp kết quả định danh xác định các chủng B.

anthracis bằng kit API50 CH. Tổng hợp các đột biến được xác định trên các chủng Bacillus anthracis. 92 vi DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1. Bacillus anthracis trên tiêu bản nhuộm Gram từ bệnh phẩm máu.

anthracis trên môi trường thạch máu cừu. Yersinia pestis trên tiêu bản nhuộm Wright - Giemsa. pestis trên môi trường thạch máu. Sơ đồ quá trình tạo dòng chứng nội tại tái tổ hợp pJET1.

Các đoạn sản phẩm PCR tương ứng với 5 cặp mồi khác nhau gen vrrA. Thông tin các cặp mồi khuếch đại gen vrrA với kích thước khác nhau. Thông tin các cặp mồi khuếch đại gen pagA với kích thước khác nhau. Thông tin các cặp mồi khuếch đại gen capA với kích thước khác nhau.

Thông tin các cặp mồi khuếch đại gen ypo2088 với kích thước khác nhau. Thông tin các cặp mồi khuếch đại gen pla với kích thước khác nhau. Thông tin các cặp mồi khuếch đại gen caf1 với kích thước khác nhau. Sản phẩm khuếch đại 3 gen đích của B.

anthracis Ba1 bằng PCR đơn mồi. Sản phẩm khuếch đại đồng thời 3 gen đích của B. anthracis bằng mPCR với 3 cặp mồi vrrAF1/R1, pagAF1/R1, capAF1/R1. Sản phẩm khuếch đại 3 gen đích của Y.

pestis Yp1 bằng PCR đơn mồi. Sản phẩm khuếch đại đồng thời 3 gen đích của Y. pestis Yp1 bằng mPCR với 3 cặp mồi ypo2088F1/R1, plaF1/R1, cafF1/R1. Sản phẩm PCR với 6 cặp mồi, từng loại DNA khuôn.

Sản phẩm mPCR với 6 cặp mồi, 2 loại tác nhân. Tối ưu nồng độ mồi của mPCR. Tối ưu nhiệt độ gắn mồi trong mPCR. Tối ưu nồng độ MgCl2 trong mPCR.

Tối ưu nồng độ dNTPs trong mPCR. Phân lập gen lef bằng cặp mồi IC1F-BamHI/R-NdeI và tạo dòng phụ trong vector pJET1. Các kết quả tạo dòng chứng nội tại pJET1. Kiểm tra mPCR tối ưu có bổ sung IC trong quá trình tách chiết DNA ở các nồng độ khác nhau với mẫu B.

Kiểm tra mPCR tối ưu có bổ sung chứng nội tại trong quá trình tách chiết DNA ở các nồng độ 105 và 5x104 copy. Master mix mPCR được đóng gói kèm hướng dẫn sử dụng. Xác định ngưỡng phát hiện B. Xác định ngưỡng phát hiện Y.

Kiểm tra mPCR trên bộ mẫu chuẩn độ nhạy với B. Kiểm tra mPCR trên bộ mẫu chuẩn độ nhạy với Y. Kiểm tra mPCR trên bộ mẫu chuẩn độ nhạy với B. Đánh giá độ đặc hiệu với B.

anthracis của bộ kit BaYp-mPCR. Kiểm định độ đặc hiệu với Y. pestis của bộ kit BaYp-mPCR. Kiểm tra mPCR ngay sau khi tạo master mix.

Kiểm tra độ ổn định của mPCR sau thời gian bảo quản một tháng. Kiểm tra độ ổn định của mPCR sau thời gian bảo quản 12 tháng. Khuẩn lạc các chủng nghi ngờ B. anthracis trên thạch máu cừu.

Định danh chủng B. anthracis Ba3 bằng kit API 50 CH. pestis trên môi trường thạch máu. Xác định đồng thời B.

pestis bằng kỹ thuật mPCR tối ưu chứa chứng nội tại IC. Kiểm tra sản phẩm tổng hợp các gen đích của B. Kiểm tra sản phẩm tổng hợp các gen đích của Y. Tạo dòng gen pagA trong vector pJET1.

So sánh trình tự nucleotide gen vrrA của 10 chủng B. anthracis với các chủng tham chiếu trên Genbank. Xác định một số đột biến điểm trên trình tự nucleotide gen pagA của 3 chủng Ba1, Ba3 và Ba4 khi so sánh với 15 chủng B. anthracis tham chiếu.

So sánh trình tự gen capA của 3 chủng B. anthracis với 12 chủng B. anthracis tham chiếu trên Genbank (đoạn nucleotide có đột biến điểm). So sánh trình tự axit amin của protein được mã hóa bởi gen capA 3 chủng B.

anthracis Ba1, Ba3 và Ba4 với 12 chủng tham chiếu trên Genbank. So sánh trình tự nucleotide và axit amin (gen pla) của 2 chủng Y. pestis Yp1, Yp2 với 4 chủng tham chiếu. 93 ix MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn.

i Lời cam đoan. ii Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt. iii Danh mục bảng. vi Danh mục hình.

viii MỞ ĐẦU. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN B. Tổng quan về vi khuẩn B.

Tổng quan về vi khuẩn Y. pestis và vũ khí sinh học. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH B. Các phương pháp vi sinh truyền thống.

Các phương pháp xác định sinh hóa. Các phương pháp xác định dựa trên ái lực. Các phương pháp xác định dựa trên axit nucleic. KIỂM ĐỊNH KIT mPCR CHẨN ĐOÁN.

Kiểm định kit PCR chẩn đoán trên thế giới. Kiểm định kit mPCR chẩn đoán B. pestis ở Việt Nam. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU. Các chủng vi khuẩn, plasmid .