Luận án: Nghiên cứu tính kháng kháng sinh phân tử Salmonella spp. trong thực phẩm TP.HCM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM TRƯƠNG HUỲNH ANH VŨ NGHIÊN CỨU TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ CỦA SALMONELLA SPP. PHÂN LẬP TỪ THỰC PHẨM TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số ngành: 9.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM  TRƯƠNG HUỲNH ANH VŨ NGHIÊN CỨU TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ CỦA SALMONELLA SPP.

PHÂN LẬP TỪ THỰC PHẨM TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 9.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS. NGUYỄN HOÀNG KHUÊ TÚ Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án “Nghiên cứu tính kháng kháng sinh ở mức độ phân tử của Salmonella spp. phân lập từ thực phẩm tại thành phố Hồ Chí Minh” là công trình của tôi thực hiện với sự hướng dẫn của PGS. TS Nguyễn Hoàng Khuê Tú.

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án này là trung thực và chưa từng được người khác công bố trong bất kỳ công trình nào khác. TÁC GIẢ LUẬN ÁN TRƯƠNG HUỲNH ANH VŨ LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, trước tiên tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Cô PGS. TS Nguyễn Hoàng Khuê Tú đã dành nhiều thời gian, công sức và tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm TP.

HCM; quý Thầy/Cô trong Khoa Khoa học Sinh học; Phòng Đào tạo Sau đại học đã nhiệt tình giúp đỡ, hướng dẫn thực hiện các thủ tục theo quy chế đào tạo nghiên cứu sinh để tôi có thể hoàn thành chương trình học tập đúng tiến độ. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Sở Khoa học và Công nghệ; Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ TP. HCM; Ban Giám đốc và toàn thể Anh/Chị/Em Phòng Vi sinh; Phòng Hành chính Quản trị, Trung tâm Dịch vụ Phân tích Thí nghiệm TP. HCM đã ủng hộ và hỗ trợ về kinh phí, trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất,…để thực hiện nghiên cứu.

Tôi xin cảm ơn Ban Giám đốc Trung tâm Kiểm nghiệm Vệ sinh An toàn Thực phẩm Khu vực phía Nam, Viện Y tế Công cộng TP. HCM; quý Thầy/Cô và các bạn sinh viên Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm, Đại học Công nghiệp TP. HCM đã động viên, giúp đỡ và chia sẽ kinh nghiệm trong quá trình thực hiện luận án. Cuối cùng, sự thành công của luận án không thể không kể đến sự đóng góp không nhỏ của các thành viên trong gia đình, những người luôn ủng hộ, động viên và giúp tôi vượt qua rất nhiều khó khăn, trở ngại trong suốt thời gian học tập.

Chân thành cám ơn. i TÓM TẮT Luận án “Nghiên cứu tính kháng kháng sinh ở mức độ phân tử của Salmonella spp. phân lập từ thực phẩm tại thành phố Hồ Chí Minh” được thực hiện tại Trung tâm Dịch vụ Phân tích Thí nghiệm thành phố Hồ Chí Minh. Tỷ lệ nhiễm Salmonella spp.

của các nhóm thực phẩm thu thập tại các chợ bán lẻ trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh từ 09/2019 đến 09/2020 là 16,84% (256/1. Nhóm mẫu thịt có tỷ lệ nhiễm cao nhất, tiếp theo là nhóm mẫu thủy hải sản và cuối cùng là nhóm mẫu rau củ quả có tỷ lệ lần lượt là 43,16% (164/380), 23,95% (91/380), 0,26% (01/380). Chưa ghi nhận trường hợp nào thuộc nhóm mẫu trứng có nhiễm Salmonella. Các kháng sinh TE, AMP, STR, C và SXT có tỷ lệ Salmonella spp.

kháng từ 34,67% đến 52,00%. Ngược lại, 96,00% nhạy với CAZ. Từ 21 chủng Salmonella spp. có kiểu hình đa kháng định danh được 07 serovar, phổ biến nhất là S.

Các integron nhóm 1, 2 và 3 ở các serovar Salmonella đa kháng được phát hiện lần lượt là 100% (21/21), 52,38% (11/21) và 100% (21/21). Tỷ lệ Salmonella mang cùng lúc ba nhóm integron là 52,38% (11/21). Kết quả khảo sát vùng gen cassette dương tính với integron nhóm 1 chiếm 85,71%; nhóm 2 là 72,73%. Kết quả khảo sát phát hiện 100% serovar đều mang plasmid không tương hợp.

Serovar mang nhiều plasmid nhất là Kentucky (08 plasmid); Potsdam (07 plasmid); Infantis, Saintpaul, Braenderup, Agona và 7:1,z6:UT (05 plasmid); Indiana và OMF:1,z6:UT (04 plasmid). Gen mã hóa sinh ESBL được phát hiện thì blaTEM chiếm tỷ lệ cao nhất 52,38%, đột biến tại vị trí codon 90 (Asp90Gly) trên chủng SA11/19 3497. Gen blaCTX có tỷ lệ 19,05%, đột biến tại vị trí codon 80 (Ala80Val) trên các chủng SA07/20 1066, SA07/20 1067 và SA12/19 1600. Gen kháng nhóm quinolon, đột biến được phát hiện trên gen gyrA (Ser83Phe; Asp87Asn) và parC (Thr57Ser; Ser80Ile; Ser395Asn; Ala469Ser; Thr620Ala).

Ngoài ra, chúng tôi còn ghi nhận tính đa kháng của các Salmonella enterica sups. serovar Kentucky có liên quan đến yếu tố di truyền chuyển vị là Tn21 mã hóa Urf2 hiện nay chưa có công bố nào mô tả chi tiết chức năng hoạt động của chúng. ii SUMMARY The thesis “Research on molecular characteristics of antibiotic resistance in Salmonella spp. isolated from food in Ho Chi Minh City” was performed at the Center of Analytical Service and Experimentation Ho Chi Minh City.

The results showed that the contaminated rate of Salmonella spp. Meat samples had the highest contamination rate, followed by the seafood samples and finally fruit and vegetable samples which were 43. There was no Salmonella detected in the egg samples. Testing the antibiotic sensitivity of 150 isolated Salmonella strains showed that of the resistantt rates to AMP, STR, C, and SXT were from 34.

In contrast, Salmonella spp. were highly susceptible to CAZ (96. There were 07 serovar phenotypes determined from 21 strains of multidrug-resistant Salmonella spp. in which the most common ones were S.

Specifically, all integrons (I, II, and III) were found in multidrug-resistant Salmonella serovars isolated from food groups at 100% (21/21), 52. The rate of Salmonella carrying all three integron groups was 52. The assessment of the gene cassette region of integron I was accounted for 85. We found that 100% of serovars carried plasmids incompatibility.

Serovar carrying the most plasmids was Kentucky (8 plasmids); Potsdam (7 plasmids); Infantis, Saintpaul, Braenderup, Agona and 7:1,z6:UT (5 plasmids); Indiana and OMF:1,z6:the UT (4 plasmids). In the detection of ESBL encoding genes, the blaTEM gene accounted for the highest rate of 52.38%, mutations at codon position 90 (Asp90Gly) on strain SA11/19 3497. The blaCTX gene had the rate of 19.05%, mutations varying at codon position 80 (Ala80Val) on strains SA07/20 1066, SA07/20 1067 and SA12/19 1600. The resistance genes against the quinolone group, mutations were detected in the gyrA (Ser83Phe; Asp87Asn) and parC (Thr57Ser; Ser80Ile; Ser395Asn; Ala469Ser; Thr620Ala) genes.

Interestingly, we noted the multi- resistance of Salmonella enterica sups. iii Kentucky serovars which were related to the translocation genetic factor Tn21 encoding Urf2 that was not studied or described the function in detail. iv KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt Ala Alanine AMC Amoxicillin/Clavunic acid Kháng sinh Amoxicillin/Clavunic acid AMP Ampicillin Kháng sinh Ampicillin Asn Asparagine Asp Aspartic acid AX Amoxicillin Kháng sinh Amoxicillin C Chloramphenicol Kháng sinh Chloramphenicol CAZ Ceftazidime Kháng sinh Ceftazidime CRO Ceftriaxone Kháng sinh Ceftriaxone CS Conserved segment Vùng bảo tồn CI Confidence Interval Khoảng tin cậy CIP Ciprofloxacin Kháng sinh Ciprofloxacin Clinical and Laboratory Standards Viện tiêu chuẩn lâm sàng và xét CLSI Institute nghiệm CTX Cefotaxime Kháng sinh Cefotaxime DNA Deoxyribonucleic Acid European Centre for Disease Trung tâm Phòng chống Dịch bệnh ECDC Prevention and Control châu Âu EFSA European Food Safety Authority Cơ quan An toàn Thực phẩm châu Âu Extended Spectrum Beta- ESBL Beta lactamase phổ rộng lactamase FX Furazolidone Kháng sinh Furazolidone Gly Glycine GM Gentamycin Kháng sinh Gentamycin Ile Isoleucine K Kanamycin Kháng sinh Kanamycin kbp Kilobase pairs Cặp bazơ MLST Multi Locus Sequence Typing Giải trình tự nhiều locus MIC Minimal Inhibited Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu m-PCR Multiplex-PCR PCR đa mồi NA Nalidixic acid Kháng sinh Nalidixic acid National Antimicrobial Resistance Hệ thống giám sát kháng khuẩn quốc NARMS Monitoring System gia Hoa Kỳ v NOR Norfloxacin Kháng sinh Norfloxacin NTS Non-typhoidal Salmonella Salmonella không gây sốt thương hàn OFX Ofloxacin Kháng sinh Ofloxacin orf Open reading frame Khung đọc mở P Penicillin Kháng sinh Penicillin PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase Phe Phenylalanine Plasmid Mediated Quinone Gen kháng quinolone nằm trên PMQR Resistance plasmid ppm Parts Per Million Phần triệu Quaternary ammonium qac Hợp chất amoni bậc 4 compounds RA Rifampin Kháng sinh Rifampin RNA Ribonucleic Acid RNAi RNA interference Sự can thiệp RNA Ser Serine SMZ Sulphamethoxazole Kháng sinh Sulphamethoxazole SPI Salmonella Pathogenicity Islands Đảo gây bệnh Salmonella SPT Spectinomycin Kháng sinh Spectinomycin STR Streptomycin Kháng sinh Streptomycin Kháng sinh SXT Sulfamethoxazole/Trimethoprim Sulfamethoxazole/Trimethoprim s-PCR Simplex-PCR PCR đơn mồi T Oxytetracycline Kháng sinh Oxytetracycline TE Tetracycline Kháng sinh Tetracycline Thr Threonine TMP Trimethoprim Kháng sinh Trimethoprim TOB Tobramycin Kháng sinh Tobramycin Val Valine WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới vi MỤC LỤC TRANG LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii SUMMARY iii KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT v MỤC LỤC vii DANH MỤC CÁC BẢNG xi MỞ ĐẦU 1 Đóng góp mới của luận án 2 CHƯƠNG 1 3 TỔNG QUAN 3 1.1 Tình hình thực phẩm nhiễm Salmonella spp. trên thế giới--------------------------3 1.2 Tình hình thực phẩm nhiễm Salmonella spp.

tại Việt Nam-------------------------4 1.3 Thực trạng sử dụng và tồn dư kháng sinh----------------------------------------------5 1.4 Tình hình kháng kháng sinh của Salmonella spp. trên thế giới---------------------6 1.5 Tình hình kháng kháng sinh của Salmonella spp. tại Việt Nam--------------------7 1.6 Đặc điểm sinh học của Salmonella spp-------------------------------------------------9 1.1 Đặc điểm hình thái 9 1.2 Đặc tính nuôi cấy 9 1.3 Đặc tính sinh hóa 9 1.5 Hệ gen của Salmonella spp.7 Cơ chế kháng aminoglycoside của Salmonella spp---------------------------------12 1.8 Cơ chế kháng β-lactam của Salmonella spp------------------------------------------13 1.9 Cơ chế kháng phenicol của Salmonella spp------------------------------------------14 1.10 Cơ chế kháng quinolone của Salmonella spp---------------------------------------15 1.11 Cơ chế kháng tetracycline của Salmonella spp-------------------------------------15 1.12 Cơ chế kháng sulfonamide/trimethoprim của Salmonella spp-------------------16 vii 1.13 Tình hình nghiên cứu gen kháng kháng sinh của Salmonella spp---------------16 1.14 Yếu tố di truyền di động 18 1.3 Integron nhóm 3, 4 và 5 21 1.3 Gen cassette 22 CHƯƠNG 2 23 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.2 Môi trường nuôi cấy, hóa chất, thuốc thử dùng phân lập Salmonella spp-----23 2.3 Môi trường dùng khảo sát tính nhạy với kháng sinh của Salmonella spp-----24 2.4 Hóa chất sinh học phân tử 24 2.5 Chủng chuẩn vi sinh vật dùng làm kiểm soát--------------------------------------25 2.2 Phương pháp 26 2.1 Phương pháp xác định cỡ mẫu 26 2.2 Phương pháp lấy và bảo quản mẫu--------------------------------------------------26 2.3 Phương pháp phân lập Salmonella spp------------------------------------------------26 2.1 Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu-------------------------------------------26 2.2 Tăng sinh sơ bộ không chọn lọc 26 2.3 Tăng sinh chọn lọc 27 2.4 Phương pháp xác định serovar của Salmonella spp.5 Khảo sát tính nhạy với kháng sinh của Salmonella spp----------------------------29 2.1 Lựa chọn kháng sinh thử nghiệm 29 viii 2.2 Phương pháp xác định tính nhạy với kháng sinh của Salmonella spp----------29 2.6 Ly trích DNA của Salmonella spp.7 Phương pháp phát hiện Salmonella spp. bằng kỹ thuật PCR----------------------30 2.