Luận án tiến sĩ: Cao chiết thảo dược kháng S. agalactiae trên cá rô phi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HÞC NÔNG LÂM TP. HCM ÷ö÷ö NGUYỄN THỊ TRÚC QUYÊN NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CAO CHIẾT THẢO DƯỢC NÂNG CAO KHẢ NNG KHÁNG BỆNH DO Streptococcus agalactiae GÂY RA TRÊN CÁ RÔ PHI (Oreochromis spp.) Chuyên ngành: Công nghệ sinh hßc Mã số: 9.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – Nm 2024 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TR¯àNG ĐẠI HàC NÔNG LÂM TP. HCM ÷ö÷ö NGUYỄN THỊ TRÚC QUYÊN NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CAO CHIẾT THẢO DƯỢC NÂNG CAO KHẢ NNG KHÁNG BỆNH DO Streptococcus agalactiae GÂY RA TRÊN CÁ RÔ PHI (Oreochromis spp.) Chuyên ngành: Công nghệ sinh hác Mã số: 9.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ng°ái h°ßng dẫn khoa hác: TS. Nguyễn Thß Ngác Tĩnh PGS.

Từ Thanh Dung Thành phố Hồ Chí Minh – Nm 2024 i LàI CÁM ¡N Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến TS. Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh và PGS. Từ Thanh Dung vì sự tận tình hướng dẫn, hỗ trợ, truyền đ¿t kiến thức cho tôi trong thßi gian học tập, thực hiện và hoàn thành luận án. Tôi xin được chân thành cám ơn Ban Giám hiệu Ban ch nhiệm c ng tập thể Khoa Khoa học Sinh học và Ph ng Sau đ¿i học thuộc Trưßng Đ¿i học Nông Lâm TP.

Hồ Chí Minh đã giúp đỡ và t¿o mọi điều kiện tốt nhÃt giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng gửi lßi cÁm ơn đến Ban Lãnh đ¿o cùng các cán bộ t¿i Trung tâm Quan trắc môi trưßng và bệnh thuỷ sÁn Nam Bộ, Phòng Sinh học thực nghiệm, Tr¿i Nghiên cứu Thực nghiệm Th y sÁn G VÃp thuộc Viện Nghi n cứu Nuôi trồng Th y sÁn II đã hỗ trợ và t¿o mọi điều iện về cơ sá vật chÃt cho tôi trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu. Đồng thßi tôi xin cám ơn anh Đoàn Văn Cưßng - ngưßi đã tận tình hỗ trợ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi xin được gửi ßi cám ơn đến Ban Giám đốc c ng các đồng nghiệp Sá Nông nghiệp và Phát triển nông thôn tỉnh Đồng Nai đã ng hộ, t¿o điều kiện về thßi gian để tôi có thể học tập và hoàn thành luận án.

Xin chân thành cám ơn những Thầy/Cô, anh chị Khoa Th y sÁn c a Trưßng Đ¿i học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh cùng các anh chị em Nghiên cứu sinh ngành Công nghệ sinh học khóa 2016, các em sinh viên đã hỗ trợ động viên tôi hoàn thành các nội dung c a luận án. Tôi vô cùng biết ơn gia đình Chồng và Các con tôi - những ngưßi đã luôn yêu thương á bên c¿nh để động viên, hỗ trợ về tinh thần lẫn vật chÃt cho tôi trong suốt thßi gian học tập và thực hiện Luận án. Xin chân thành cám ơn.

Tác giÁ luÁn án ii LàI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các kết quÁ trình bày trong luận án là trung thực và một phần kết quÁ thuộc nhiệm vụ khoa học và công nghệ <Nghi n cứu phòng trị bệnh do liên cầu khuẩn Streptococcus agalactiae bằng thÁo dược trên cá rô phi giống (Oreochromis spp.) nuôi t¿i Thành phố Hồ Chí Minh= được tài trợ kinh phí bái Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh (thuộc Sá Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh) cho Trung tâm Quan trắc môi trưßng và bệnh thuỷ sÁn Nam Bộ theo Hợp đồng số 26/2018/HĐ-QKHCN. Những số liệu, kết quÁ trong luận án được phép công bố với sự đồng ý c a ch nhiệm đề tài, nhóm tác giÁ, cộng tác vi n và chưa từng được công bố bái tác giÁ khác. Tác giÁ luÁn án NGUYàN THà TRÚC QUYÊN iii TÓM TÂT Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 11 năm 2017 đến tháng 12 năm 2022 với các nội dung gồm: (1) Xác định khÁ năng kháng vi khuẩn gây bệnh Streptococcus agalactiae á điều kiện in vitro c a cao chiết vỏ quế và cao chiết gừng; (2) Xác định Ánh hưáng c a cao chiết lên tăng trưáng và khÁ năng bÁo vệ cá rô phi kháng l¿i vi khuẩn gây bệnh S. agalactiae trong điều kiện phòng thí nghiệm; (3) Xác định Ánh hưáng c a cao chiết lên chỉ tiêu máu, một số chỉ tiêu miễn dịch và hình thái ruột c a cá rô phi; và (4) KhÁo sát khÁ năng kháng khuẩn c a cao chiết vỏ quế và cao chiết gừng dựa tr n hàm ượng ho¿t chÃt chính.

Cao chiết vỏ quế và cao chiết gừng được chiết xuÃt trong dung môi ethanol 96% và methanol 99,8% được ghi nhận à có khÁ năng diệt vi khuẩn S. agalactiae á điều kiện in vitro trong số 6 lo¿i thÁo dược được khÁo sát. Nghiên cứu trong điều kiện in vivo cho thÃy, cao chiết gừng và cao chiết vỏ quế với các hàm ượng 10 20 và 40 g/kg được bổ sung vào thức ăn trong 8 tuần hông àm Ánh hưáng đến sự sinh trưáng và phát triển c a cá rô phi giống. B n c¿nh đó với thßi gian bổ sung 28 ngày và tiếp tục trong 10 ngày sau hi cá được cÁm nhiễm với S.

agalactiae, các cao chiết tr n đã cho thÃy hiệu quÁ hỗ trợ nâng cao khÁ năng háng bệnh do S. agalactiae gây ra; đồng thßi cao chiết vỏ quế còn giúp gia tăng hÁ năng hÃp thu chÃt dinh dưỡng trên cá rô phi giống. Hiệu quÁ bÁo vệ cao nhÃt với vi huẩn S. agalatiae (RPS đ¿t 51 4%) trên cá được cho ăn hẩu phần có bổ sung cao chiết vỏ quế với hàm ượng 20 g/ g thức ăn.

Nghi n cứu cho thÃy, ho¿t chÃt cinnamic aldehyde với hàm ượng 100 µg/g thức ăn và 200 µg/g thức ăn có khÁ năng háng vi khuẩn S. Ngoài ra, nghiên cứu đã cho thÃy sự hiện diện c a vi khuẩn S. agalactiae mang các yếu tố độc lực quan trọng và thuộc CC283, kiểu trình tự ST283 t¿i huyện C Chi, Thành phố Hồ Chí Minh. Các kết quÁ trong nghiên cứu này đã giúp hẳng định tiềm năng ứng dụng c a cao chiết vỏ quế và cao chiết gừng trong việc nâng cao khÁ năng háng bệnh do vi khuẩn S.

agalactiae gây ra trên cá rô phi giống. iv ABTRACTS The study was conducted from November 2017 to December 2022, with the contents included: (1) Determination of the ability to antagonize pathogenic bacteria S. agalactiae under in vitro conditions of cinnamon bark (Cinnamomum verum) and ginger (Zingiber officinale) extracts; (2) Determination of the effect of extract on growth and ability to protect tilapia against pathogenic bacteria S. agalactiae under experimental conditions; (3) Determination of the effect of the extract on blood and immune parameters, and morphological parameters of tilapia intestine; and (4) Investigation of antibacterial properties of cinnamon bark and ginger extracts based on the content of main active ingredients.

Ginger and cinnamon bark extracts in ethanol 96% and methanol 99.8% have ability to against two strains of S. agalatiae under in vitro conditions among 6 tested herbs. The study under in vivo conditions confirmed that, the addition of ginger and cinnamon extracts with concentrations of 10, 20 and 40 g/kg to the feed gave no effect for the growth and development of tilapia at fingerling stage. At the same time, in the period of 28 days and continuing to supplement for 10 days after fish injected intraperitoneally to S.

agalactiae, the ginger and cinnamon extracts provided the protective effect in enhancing the fish against to S. agalactiae; besides, cinnamon extract also increased nutrient absorption ability in tilapia fingerlings. The addition of cinnamon extract with the concentration of 20 g/kg of feed had the highest protective effect with S. agalatiae (with the RPS value being 51.

The results have determined the S. agalactiae bactericidal ability of cinnamic aldehyde with the content of 100 µg/g feed and 200 µg/g feed. Moreover, this study has shown the presence of bacteria S. agalactiae CC283, ST283 sequence bringing important virulence factors in Cu Chi district, Ho Chi Minh city, Vietnam.

The results in the study confirmed the potential of cinnamon and ginger extracts in enhancing the resistance to S. agalactiae in tilapia fingerlings. v MĀC LĀC LàI CÁM ¡N&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& i LàI CAM ĐOAN&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&. v DANH SÁCH CHĀ VI¾T TÂT&&&&&&&&&&&&&&&&.

ix DANH MĀC BÀNG&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&. xi DANH MĀC HÌNH&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&. xiii Mâ ĐÀU&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&. 1 Ch¤¢ng 1 TàNG QUAN&&&&&&&&&&&&&&&&&&&.1 Tổng quan về cá rô phi………………………………………………….1 Phân lo¿i khoa học và nguồn gốc………………………………………….2 Đặc điểm sinh học………………………………………………………… 6 1.3 Tình hình sÁn xuÃt cá rô phi trên thế giới và á Việt Nam………………… 7 1.2 Tổng quan về vi huẩn S.1 Đặc điểm hình thái, sinh hóa……………………………………………… 8 1.2 Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích ………………………………….3 Phân nhóm và độc lực c a vi khuẩn S.2 Các yếu tố độc lực…………………………………………………….4 Tình hình dịch bệnh do vi khuẩn S.

agalactiae gây ra…………………….1 Đối với động vật thủy sản………………………………………….2 Đối với cá rô phi………………………………………………….3 Sử dụng thÁo dược phòng trị bệnh do vi khuẩn Streptococcus sp. agalactiae gây ra trên th y sÁn………………………………………….1 Nghiên cứu khÁ năng háng Streptococcus sp.2 Nghiên cứu Ánh hưáng c a thÁo dược n tăng trưáng, sức khỏe vi cá………………………………………………………………….4 Đáp ứng miễn dịch trên cá xương và tác động c a thÁo dược lên hình thái biểu mô c a cá…………………………………………………………………….1 Đáp ứng miễn dịch tr n cá xương………………………………………… 20 1.2 Tác động c a thÁo dược lên hình thái biểu mô c a cá…………………… 20 1.5 Giới thiệu các lo¿i thÁo dược sử dụng trong nghiên cứu…………………….6 Phương pháp chiết xuÃt thÁo dược dùng trong nghiên cứu………………….1 Chiết xuÃt ngÃm kiệt…………………………………………………….2 Chiết xuÃt bằng dung môi hữu cơ á nhiệt độ cao……………………….7 Cơ sá lựa chọn các nội dung nghiên cứu…………………………………… 26 Ch¤¢ng 2 PH£¡NG PHÁP NGHIÊN CĀU&&&&&&&&&&&.1 Thßi gian địa điểm nghiên cứu……………………………………………… 27 2.2 Nội dung nghi n cứu…………………………………………………….3 Vật iệu nghi n cứu………………………………………………………….2 Nguồn cá bệnh dùng trong nghiên cứu…………………………………….3 Cá dùng trong thí nghiệm in vivo.4 Thức ăn hóa chÃt, dụng cụ, thiết bị.4 Phương pháp nghi n cứu………………………………………………… ….1 Nội dung 1: Xác định khÁ năng háng vi huẩn gây bệnh S. agalactiae á điều kiện in vitro c a một số dịch chiết và cao chiết thÁo dược………………… 30 2.1 Phân lập và định danh vi khuẩn S.2 Khảo sát khả năng kháng S. agalactiae của cao chiết dạng thô……….3 Xác định giá trị MIC và MBC của cao chiết dạng thô……………… 36 2.2 Nội dung 2: Xác định Ánh hưáng c a cao chiết lên tăng trưáng và khÁ năng bÁo vệ cá rô phi kháng l¿i vi khuẩn gây bệnh S.1 Xác định ảnh hưởng của cao chiết lên tăng trưởng………………… 37 vii 2.2 Xác định giá trị LD50 và các yếu tố độc lực………………………….3 Xác định ảnh hưởng của cao chiết lên khả năng bảo vệ cá rô phi…….3 Nội dung 3: Xác định Ánh hưáng c a cao chiết lên các chỉ tiêu máu, chỉ tiêu miễn dịch và hình thái ruột c a cá rô phi…………………………………… 44 2.1 Bố trí thí nghiệm………………………………………………….3 Phân tích tế bào máu và các chỉ tiêu miễn dịch…………………….4 Phân tích chỉ tiêu hình thái mô ruột cá………………………….4 Nội dung 4: Xác định hàm ượng ho¿t chÃt chính và hÁo sát tính háng huẩn c a cao chiết thÁo dược dựa tr n hàm ượng ho¿t chÃt chính…………….