Luận án tiến sĩ nghiên cứu biểu hiện gen GmDREB6 nhằm nâng cao khả năng chịu mặn ở cây chuyển gen - Phutthakone VACIAXA

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM Phutthakone VACIAXA NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN GmDREB6 NHẰM NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU MẶN Ở CÂY CHUYỂN GEN LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Thái Nguyên, tháng 10/2021 luan an ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM Phutthakone VACIAXA NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN GmDREB6 NHẰM NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU MẶN Ở CÂY CHUYỂN GEN Ngành: Di truyền học Mã số: 9420121 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. Chu Hoàng Mậu 2. Phạm Thị Thanh Nhàn Thái Nguyên, tháng 10/2021 luan an i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của GS. Chu Hoàng Mậu và TS.

Phạm Thị Thanh Nhàn (Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên). Các kết quả được trình bày trong luận án là trung thực một phần đã được công bố trên các Tạp chí Khoa học và Công nghệ quốc gia và quốc tế, phần còn lại chưa công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tất cả các nội dung trích dẫn trong luận án đều ghi rõ nguồn gốc. Thái Nguyên, tháng 10 năm 2021 TÁC GIẢ Phutthakone VACIAXA luan an ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới GS.

Chu Hoàng Mậu và TS. Phạm Thị Thanh Nhàn đã trực tiếp hướng dẫn và thường xuyên chia sẻ, động viên khích lệ để tôi có được sự tự tin và lòng đam mê khoa học giúp tôi hoàn thành bản luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô giáo và cán bộ Bộ môn Di truyền học và Công nghệ sinh học thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Tôi xin cảm ơn những ý kiến đóng góp quý báu trong các buổi seminar khoa học, báo cáo chuyên đề và báo cáo tiểu luận tổng quan luận án.

Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của tập thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo và cán bộ Khoa Sinh học, các thầy cô giáo và cán bộ bộ phận đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận án và hoàn thành khoá học này. Tôi xin cảm ơn lãnh đạo Trường Cao đẳng Sư phạm Khang Khay, Xiêng Khoảng, Lào đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa học tại Việt Nam.

Tôi rất biết ơn những người thân trong gia đình, các bạn bè đã luôn động viên, quan tâm, tạo mọi điều kiện cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Thái Nguyên, tháng 10 năm 2021 TÁC GIẢ Phutthakone VACIAXA luan an iii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan …………………………………………………………… i Lời cảm ơn ……………………………………………………………… ii Mục lục ……………. iii Danh mục bảng trong luận án ………. vi Danh mục hình trong luận án ……….… vii Danh mục chữ viết tắt trong luận án …………….……………………… ix MỞ ĐẦU….

Mục tiêu nghiên cứu ……………………………………. Nội dung nghiên cứu ………………………………………………… 3 4. Những đóng góp mới của luận án …………………………………… 4 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án …………………… 5 Chương 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU ………. CÂY ĐẬU TƯƠNG VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN, CHỊUMẶN … 6 1. Cây đậu tương …………………. Đặc tính chống chịu hạn, mặn của cây đậu tương………….

Tác động của hạn và cơ chế phân tử của tính chịu hạn. Tác động của mặn và cơ chế chịu mặn ở cây đậu tương………… 14 1. NHÂN TỐ PHIÊN MÃ DREB Ở THỰC VẬT VÀ CÂY ĐẬU TƯƠNG. Đặc điểm của phân họ DREB ở thực vật và cây đậu tương ……….

Vai trò của DREB trong việc điều chỉnh phản ứng với stress phi sinh học ở thực vật…………………………………. Khả năng chống chịu stress thông qua việc biểu hiệu mạnh nhân tố phiên mã DREB ………………………………………………… 31 luan an iv 1. KỸ THUẬT CHUYỂN GEN TRONG NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN ĐẶC TÍNH CHỐNG CHỊU CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG ……………… 37 1. Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen thông qua A.

Nghiên cứu cải thiện khả năng chống chịu các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh ở cây đậu tương bằng kỹ thuật chuyển gen ………………… 41 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ………… 46 2. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu ……………………………………… 48 2.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………………………………… 48 2. Nhóm phương pháp phân tích phân họ gen DREB ở cây đậu tương. Nhóm phương pháp thiết kế vector chuyển gen thực vật và phân tích hoạt động của vector biển hiện gen GmDREB6 trên cây thuốc lá. Nhóm phương pháp phân tích mức độ biểu hiện của gen GmDREB6, NtP5CS, NtCLC trên cây thuốc lá chuyển gen……………… 55 2.

Nhóm phương pháp chuyển gen GmDREB6 vào cây đậu tương 58 2. Phương pháp phân tích và xử lý dữ liệu …………………………. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU VÀ HOÀN THÀNH LUẬN ÁN. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN…………….

ĐẶC ĐIỂM VÀ SỰ PHÁT SINH CỦA PHÂN HỌ GEN DREB Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG …………………………………………………… 62 3. Kết quả xác định các gen trong phân họ gen DREB ở cây đậu tương. Sự phát sinh của các thành viên trong phân họ gen GmDREB ở cây đậu tương ………………………………………………………………… 65 3. Cây phát sinh miền AP2 ở đậu tương ………………….

THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN GmDREB6 VÀ PHÂN TÍCH HOẠT ĐỘNG CỦA VECTOR TRÊN CÂY THUỐC LÁ……………… 71 3.Thiết kết vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen GmDREB6 … 71 3. Biến nạp cấu trúc pBI121_GmDREB6 vào mô cây thuốc lá ……… 76 3. PHÂN TÍCH SỰ BIỂU HIỆN CỦA GEN GmDREB6, NtP5CS, NtCLC TRÊN CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN BẰNG REAL TIME qRT-PCR ………………………………………………………………… 80 3. Xử lý mặn các dòng thuốc lá chuyển gen GmDREB6 và cây WT.

Phân tích mức độ biểu hiện của các gen GmDREB6, NtP5CS và NtCLC phản ứng với stress mặn ở các dòng thuốc lá chuyển gen ………. Thảo luận kết quả biểu hiện gen GmDREB6, NtP5CS, NtCLC ở các dòng thuốc lá chuyển gen ………. BIẾN NẠP CẤU TRÚC MANG GEN GmDREB6 THÔNG QUA AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Ở GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT22. Biến nạp và tạo cây đậu tương chuyển gen GmDREB6 từ giống đậu tương ĐT22 ………………………………………………………….

Phân tích sự hiện diện và sự phiên mã của gen chuyển GmDREB6 trên cây đậu tương chuyển gen …………………………………………. Thảo luận kết quả chuyển gen GmDREB6 ở cây đậu tương ……… 93 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ……………………………………………. 95 CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN …… 97 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 122 luan an vi DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.

Sự biểu hiện quá mức của gen DREB phản ứng với các stress phi sinh học ở các cây chuyển gen …………………………… 32 Bảng 1.2 Một số gen DREB được sử dụng trong chuyển gen nhằm nâng cao khả năng chống chịu các yếu tố bất lợi phi sinh học của một số cây trồng và đậu tương ……………………………………… 41 Bảng 2. Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn ……………… 50 Bảng 2. Thành phần môi trường tái sinh cây thuốc lá chuyển gen. Trình tự nucleotide của các cặp mồi PCR sử dụng trong phân tích cây thuốc lá chuyển gen ………….

Thành phần phản ứng PCR …………………………. Trình tự nucleotide của các cặp mồi được sử dụng trong phản ứng Realtime RT-PCR………………………………………… 57 Bảng 2. Môi trường nảy mầm, đồng nuôi cấy, cảm ứng tạo chồi, tái sinh cây chuyển gen ở giống đậu tương ĐT22 ………………… 59 Bảng 3. Số bản copy và vị trí của mỗi gen GmDREB trong hệ gen cây đậu tương ……………………………………………………… 64 Bảng 3.

So sánh các điểm liên kết trong miền AP2 với sợi DNA vùng promoter của 18 thành viên trong phân họ nhân tố phiên mã DREB ở cây đậu tương………. Kết quả biến nạp cấu trúc pBI121-GmDREB6 vào mô cây thuốc lá……………………………………………………………… 77 Bảng 3. Kết quả biến nạp gen GmDREB6 vào giống đậu tương ĐT22………………………………………………………………. 91 luan an vii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.

Một số đặc điểm hình thái cây đậu tương (Glycine max). Các giai đoạn sinh trưởng của cây đậu tương ………. Sơ đồ con đường dẫn truyền tín hiệu trong tế bào khi bị stress mặn ở thực vật bậc cao ………………………………. Vị trí của gen GmDREB1 có gene ID: 547622 trên NST số 9 và GmDREB1có gene ID: 547642 trên NST số 14 của cây đậu tương ……………………………………………………………….

Vị trí của gen GmDREB2 trên NST số 6 của cây đậu tương ………………………………………………………………. Vị trí của gen GmDREB6 trên NST số 5 của cây đậu 27 tương … Hình 2. Hình ảnh của một số giai đoạn phát triển ở giống đậu tương ĐT22 được sử dụng trong thí nghiệm chuyển gen. Cây phát sinh và quan hệ tiến hóa giữa các thành viên của phân họ gen DREB ở đậu tương được thiết lập dựa trên trình tự gen GmDREB theo phương pháp Maximum Likelihood và JTT matrix- based model trong MEGAX……………………………………….

So sánh trình tự amino acid miền AP2 của các protein trong phân họ DREB ở đậu tương ………………………………… 68 Hình 3. Cây phát sinh miền AP2 của phân họ protein DREB ở đậu tương được thiết lập dựa trên 69 trình tự amino acid miền AP2 theo phương pháp Maximum Likelihood trong MEGAX và JTT matrix-based model với bootstrap được lặp lại 1000 lần…………. Trình tự nucleotide của gen GmDREB6 nhân tạo ……… 72 luan an viii Hình 3. Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen pBI121_GmDREB6.

Hình ảnh điện di của sản phẩm cắt từ vector pPU18_GmDREB6 và pBI121_GUS với cặp enzyme SacI/XbaI … 74 Hình 3. Hình ảnh điện di kiểm tra gen chuyển GmDREB6 bằng colony-PCR từ các khuẩn lạc A. Sơ đồ cấu trúc vector pBI121_GmDREB6 được sử dụng để chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Hình ảnh mô tả quá trình biến nạp cấu trúc mang gen GmDREB6 và tạo cây thuốc lá chuyển gen thông qua A.

Hình ảnh kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân bản gen chuyển GmDREB6 từ các cây thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T0 ………………………………………………………………. Hình ảnh kết quả phân tích Southern blot kiểm tra sự hợp nhất của gen chuyển GmDREB6 vào hệ gen các cây thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T0 ……………………………………. Hình ảnh kết quả điện di kiểm tra sản phầm RT-PCR khuếch đại cDNA của gen chuyển GmDREB6 từ mRNA của các cây chuyển gen thế hệ T0 ………………………………………… 79 Hình 3. Hình thái cây thuốc lá chuyển gen GmDREB6 và cây không chuyển gen khi tưới H2O và NaCl trong tủ cấy sau 3 tuần … 82 Hình 3.

Mức độ biểu hiện của gen GmDREB6 ở các dòng thuốc lá chuyển gen trong điều kiện stress mặn bằng phản ứng qRT-PCR sử dụng Actin làm gen tham chiếu. Mức độ biểu hiện của các gen NtP5CS ở các dòng thuốc lá chuyển gen GmDREB6 trong điều kiện stress mặn bằng phản ứng qRT-PCR sử dụng Actin làm gen tham chiếu……….… 84 luan an ix Hình 3.