Luận án tiến sĩ: Chế tạo hạt nano oxit sắt từ gắn protein ứng dụng y sinh - Đại học Trà Vinh

2/KHCN1-BM17 TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH HỘI ĐỒNG KHOA HỌC ISO 9001 : 2008 BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO HẠT NANO OXIT SẮT TỪ VỚI LỚP PHỦ TƯƠNG THÍCH SINH HỌC GẮN PROTEIN ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN Y SINH Chủ nhiệm đề tài: ThS. NGUYỄN VĂN SÁU Chức danh: Giảng viên Đơn vị: Khoa Khoa học Cơ bản, Trường Đại học Trà Vinh Trà Vinh, ngày 25 tháng 01 năm 2017 luan an TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH HỘI ĐỒNG KHOA HỌC ISO 9001 : 2008 BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO HẠT NANO OXIT SẮT TỪ VỚI LỚP PHỦ TƯƠNG THÍCH SINH HỌC GẮN PROTEIN ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN Y SINH Xác nhận của cơ quan chủ quản Chủ nhiệm đề tài (Ký, đóng dấu, ghi rõ họ tên) (Ký, ghi rõ họ tên) Nguyễn Văn Sáu Trà Vinh, ngày 25 tháng 01 năm 2017 luan an Tóm tắt Vật liệu nano từ tính với những tính chất đặc biệt, như siêu thuận từ, giá trị bão hòa từ cực đại cao đã mở ra các tiềm năng ứng dụng trong nhiều lãnh vực như y sinh, môi trường… Hạt nano từ tính có thể được chế tạo theo hai phương pháp cơ bản: một là từ vật liệu khối được nghiền nhỏ đến kích thước nano, hai là hình thành hạt nano từ các nguyên tử. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn phương pháp thứ hai - phương pháp đồng kết tủa. Hạt nano Fe3O4 được chế tạo bằng phương pháp đồng kết tủa với các kích thước hạt nano Fe3O4 khác nhau, hạt được chức năng hóa bởi các chất phủ tetraethyl orthosilicate (TEOS), 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES), glutaraldehyde (GA) để hình thành cấu trúc Fe3O4/SiO2/NH2/CHO có chức năng gắn kết protein A.

Các kỹ thuật hiển vi điện tử truyền qua (TEM), nhiễu xạ tia X (XRD), từ kế mẫu rung (VSM), phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR), phổ UV-Vis (UV-Vis) và hiển vi điện tử huỳnh quang được thực hiện để xác định tính chất, hình dạng và cấu trúc của các hạt nano. Bằng phương pháp Bradford có thể xác định được hiệu suất gắn kết protein A của cấu trúc Fe3O4/SiO2/NH2/CHO với các kích thước hạt nano Fe3O4 khác nhau. Kết quả cho thấy hạt Fe3O4 kích thước nhỏ (10nm) cho hiệu suất gắn kết protein A tốt hơn hạt Fe3O4 kích thước lớn (30nm). Tuy nhiên, hạt Fe3O4 với kích thước lớn hơn (30nm) có từ độ bão hòa cao hơn và gần bằng từ độ bão hòa của Fe3O4 khối nhưng vẫn giữ được tính siêu thuận từ.

i luan an MỤC LỤC Tóm tắt……………………………………………………………………i Danh mục chữ viết tắt ……………………………………………….v Danh mục hình ……….vi Lời cảm ơn……………………………………………………………….viii PHẦN I: MỞ ĐẦU. Tính cấp thiết của đề tài:. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước. Tình hình nghiên cứu trong nước.

Tình hình nghiên cứu ngoài nước. Mục tiêu của đề tài. Đối tượng, phạm vi và phương pháp nghiên cứu. Phạm vi nghiên cứu:.

Phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật đã sử dụng. 4 PHẦN II: NỘI DUNG .4 Chương 1: CHẾ TẠO HẠT NANO SẮT TỪ. Hạt nano oxit sắt. Các phương pháp chế tạo hạt nano.

Vật liệu, Thiết bị. Quy trình chế tạo hạt Fe3O4 bằng phương pháp đồng kết tủa. 17 ii luan an 1. Thực nghiệm: Chế tạo hạt nano oxít sắt từ.

18 Chương 2: CHỨC NĂNG HÓA BỀ MẶT HẠT NANO. Bao phủ bề mặt hạt nano bởi chất silane. Quy trình bọc lớp tương thích sinh học. Thực nghiệm bọc lớp tương thích sinh học.

24 Chương 3: GẮN PROTEIN LÊN HẠT NANO TỪ ĐÃ ĐƯỢC BỌC LỚP TƯƠNG THÍCH SINH HỌC. Hạt nano gắn với protein thông qua linker. Quy trình gắn protein A lên hạt nano từ. Gắn protein A lên hạt nano từ đã được bọc lớp tương thích sinh học.

Gắn biotin-FITC và biotin. Các kỹ thuật phân tích. 32 PHẦN III: KẾT LUẬN. Kết quả đề tài và thảo luận.

Tổng hợp các hạt nano từ tính. Các hạt nano Fe3O4 và hạt nano đã được bọc lớp tương thích. Các hạt nano Fe3O4, hạt nano đã được bọc lớp tương thích gắn với linker. Gắn protein A lên các hạt nano, các hạt nano đã gắn protein A gắn với biotin-FITC và gắn với biotin.

39 iii luan an 4. Hiệu suất gắn kết protein A với các hạt nano từ. Kết luận và kiến nghị. 42 Tài liệu tham khảo .51 Phụ lục 4 - Công trình công bố : .52 Tạp chí khoa học trường đại học trà vinh .52 iv luan an DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ Chữ viết tắt 1 3– amino propyl triethoxysilane APTES 2 anti-Staphylococcus aureus enterotoxin A anti-SEA 3 Biotin-fluorescein isothiocyanate biotin-FITC 4 Bovine serum albumin BSA 5 Enzyme - Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA 6 Fourier spectrum FTIR 7 Glutaraldehyde GA 8 Khoa học và công nghệ KH&CN 9 Nghiên cứu cơ bản NCCB 10 Polymerase Chain Reaction PCR 11 Sodium Dodecyl Sulfate SDS 12 Transmission electron microscopy TEM 13 Tetraethyl orthosilicate TEOS 14 Tetraethylammoniumhydroxide TEAOH 15 UV-Vis spectrum UV-Vis 16 Vibrating sample magnetometer VSM 17 X-ray diffraction XRD v luan an DANH MỤC HÌNH STT Hình Trang 1 Hình 1.

Hai cách chế tạo hạt nano: từ trên xuống và từ dưới lên 7 2 Hình 2. Sơ đồ minh họa quá trình tạo hạt nano bằng phương pháp 8 laser ablation 3 Hình 3. Ba khả năng phát triển mầm thành hạt nano. Cơ chế hình thành các hạt nano 12 5 Hình 5.

Một số máy phục vụ thí nghiệm 17 6 Hình 6. NaOH 2M được đưa nhanh vào hỗn hợp dung dịch muối sắt 18 7 Hình 7. NaOH 2M được đưa nhỏ giọt vào hỗn hợp dung dịch muối 19 sắt 8 Hình 8. Quá trình hình thành liên kết giữa chất silane với hạt nano 22 9 Hình 9.

Chức năng hóa bề mặt hạt nano Fe3O4 với APTES 23 10 Hình 10. Rung siêu âm Fe3O4 24 11 Hình 11. Hạt nano oxit sắt từ bao phủ bởi lớp bảo vệ silane gắn với 25 linker 12 Hình 12. Một số linker thường gặp 26 13 Hình 13.

Hạt nano gắn kết với protein thông qua linker 27 glutaraldehyde 14 Hình 14. Phản ứng giữa NHS ester với amine sơ cấp của protein 27 15 Hình 15. Hạt nano gắn kết với protein thông qua linker NHS ester 28 16 Hình 16. Phản ứng giữa nhóm maleimide và sulfhydryl có trong 28 protein 17 Hình 17.

Hạt nano gắn kết với protein thông qua linker NHS-PEGn 29 – maleimide. Hạt nano gắn kết với N3-Glycoprotein thông qua linker 30 NHS-Proparyl 19 Hình 19. Giản đồ XRD của các hạt nano Fe3O4 33 20 Hình 20. Ảnh TEM của các hạt nano 35 21 Hình 21.

Đường cong từ hóa của các hạt nano 36 22 Hình 22. Phổ FTIR của các hạt nano 37 vi luan an 23 Hình 23. Sự thay đổi tỷ số cường độ của NH2 và Fe3O4 khi thay đổi 38 lượng APTES phủ lên cấu trúc Fe3O4/SiO2 24 Hình 24. Ảnh hiển vi điện tử huỳnh quang của các hạt nano 40 25 Hình 25.

Phổ UV-Vis của dung dịch protein A trước và sau khi gắn 41 với Fe3O4/SiO2/NH2/CHO vii luan an LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin chân thành cám ơn Ban Giám hiệu, Phòng Khoa học Công nghệ, Khoa Khoa học Cơ bản, Trường Đại học Trà Vinh đã tạo điều kiện và cho phép tôi được thực hiện đề tài này. Tôi cũng xin chân thành cám ơn quý thầy cô Phòng Thí nghiệm Hóa –Sinh thuộc Khoa Khoa học Cơ bản, Trường Đại học Trà Vinh; Phòng Thí nghiệm Y – Sinh thuộc Khoa Khoa học Cơ bản, Trường Đại học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh đã hỗ trợ các thiết bị và tạo điều kiện cho tôi để thực hiện các thí nghiệm trong đề tài này. Sau cùng, tôi xin chân thành cám ơn Tiến sĩ Thi Trần Anh Tuấn, Tiến sĩ Nguyễn Tấn Tài - Khoa Khoa học Cơ bản, Trường Đại học Trà Vinh, Tiến sĩ Huỳnh Thanh Tuấn - Khoa Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ đã có những ý kiến góp ý hết sức khoa học và đầy ý nghĩa để tôi hoàn thành tốt báo cáo này. Xin chân thành cám ơn.

Trà Vinh, ngày 25 tháng 01 năm 2017 viii luan an PHẦN I: MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài: Vật liệu nano từ tính với những tính chất đặc biệt, như siêu thuận từ, giá trị bão hòa từ cực đại cao đã mở ra các tiềm năng ứng dụng trong nhiều lãnh vực như y sinh (Pimpha, Chaleawlert-umpon. 2014), môi trường (Shen, Tang. Trong số ấy, vật liệu nano từ tính Fe3O4 với tính chất siêu thuận từ, giá trị bão hòa từ cực đại cao, ít độc, và có khả năng tương thích sinh học tốt đang được quan tâm hơn cả, nhất là với các ứng dụng trong y sinh, như tách chiết tế bào (Pimpha, Chaleawlert-umpon .2014), xét nghiệm miễn dịch , dẫn truyền thuốc (Cleek, R.

1997) và hình ảnh (Veiseh, Gunn. Hạt nano Fe3O4 với nhiều kích thước khác nhau sẽ phù hợp hơn với các ứng dụng và các đối tượng, như kích thước của tế bào 10 μm –100 μm, virus 20 nm–450 nm, protein 5 nm–50 nm và gene 2 nm rộng, 10 nm–100 nm dài (Pankhurst, Q. Ngoài ra, khi kích thước của các hạt giảm sẽ làm tăng diện tích bề mặt dẫn đến số protein được gắn kết trên một đơn vị khối lượng hạt thường cao ( Hu, B. Hơn nữa, sự thay đổi kích thước tinh thể nano Fe3O4 có thể làm thay đổi giá trị bão hòa từ cực đại, tính siêu thuận từ và khả năng đáp ứng với từ trường ngoài của hạt nano Fe3O4, yếu tố đặc biệt quan trọng trong các ứng dụng (Andrade, Valente.

Hạt nano Fe3O4 sau khi được chế tạo chúng có xu hướng kết tụ với nhau do tương tác lưỡng cực từ mạnh và lực van der Waals (Shao, Xia. Do vậy, hạt nano từ tính cần được bao bọc bởi các chất không từ tính để tránh sự kết tụ, giảm sự lắng đọng, hạn chế sự oxi hóa của các hạt nano cũng như tạo bề mặt của chúng có những tính chất đặc thù phù hợp với từng ứng dụng (Chi, Yuan. Protein A là protein bề mặt được tìm thấy trong thành tế bào của khuẩn Staphylococcus aureus. Theo nhà sản xuất Sigma thì protein A có thể gắn kết với FITC, biotin, kháng thể ở vùng Fc.

Do vậy, protein A nếu gắn được với các hạt nano Fe3O4 đã được chức năng hóa bề mặt thì thông qua protein A hạt nano có thể gắn kết với kháng thể, FITC, biotin. Và qua đó mở ra nhiều ứng dụng trong tách chiết và chẩn đoán. Trên cơ sở đó, chúng tôi đề xuất hướng nghiên cứu chế tạo các hạt nano oxit sắt từ (Fe3O4) với những lớp phủ có khả năng thích nghi sinh học và hút bám tốt 1 luan an protein A.