Phân lập gen CP từ SMV và phát triển vector RNAi kháng bệnh đậu tương

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN ĐẠI HỌC SƯ PHẠM LÒ THỊ MAI THU Phân lập đoạn gen CP từ Soybean mosaic virus và phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi phục vụ tạo cây đậu tương chuyển gen kháng bệnh” Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 Họ tên nghiên cứu sinh: Lò Thị Mai Thu Khóa đào tạo: 2009 -2012 Người hướng dẫn khoa học: 1. Chu Hoàng Mậu 2. Chu Hoàng Hà Đơn vị đào tạo: Trường Đại học Sư phạm Cơ sở đào tạo: Đại học Thái Nguyên 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây trồng ngắn ngày, có giá trị kinh tế, dinh dưỡng cao, là nguyên liệu cho công nghiệp và có tác dụng cải tạo đất trồng và bảo vệ môi trường.

Hiện nay, năng suất và sản lượng đậu tương ở nước ta còn thấp, chất lượng hạt chưa cao do mức độ ổn định của giống, ảnh hưởng của nấm, côn trùng, vi khuẩn, virus gây bệnh và các tác động bất lợi khác từ ngoại cảnh. Đậu tương là một trong số các cây trồng dễ bị nhiễm nhiều loại virus, như virus gây bệnh khảm lá (Soybean mosaic virus – SMV), virus gây bệnh khảm vàng hại đậu đỗ (Bean yellow mosaic virus – BYMV) và một số virus gây bệnh khác. Trong đó, SMV và BYMV là những loại virus gây bệnh khảm có tác động xấu lớn nhất đến cây đậu tương. SMV và BYMV được lây nhiễm từ cây bệnh sang cây khoẻ do rệp là môi giới và virus có thể truyền qua hạt.

Khi cây đậu tương bị bệnh, lá cây có những phần xanh nhạt, đậm và biến vàng xen kẽ, lá non ở ngọn bị biến dạng, đọt non xoăn lại, các đốt thân co ngắn, cây chậm phát triển, số lượng quả ít và biến dạng, sần sùi, có vị đắng và thường lép. Bệnh khảm do SMV và BYMV gây thiệt hại đáng kể về năng suất, chất lượng và sản lượng hạt đậu tương. Năng suất đậu tương có thể giảm tới 40% khi các cây bị nhiễm virus trước khi ra hoa và 91% hạt đậu thu được có vết lốm đốm, chất lượng kém [87]. Việc nhiễm cùng lúc nhiều loại virus khác nhau sẽ gây thiệt hại lớn về năng suất và chất lượng hạt [95].

Hiện nay, trong sản xuất đậu tương chủ yếu mới dừng ở biện pháp phòng mà vẫn chưa có thuốc trị bệnh khảm do SMV và BYMV. Do đó các biện pháp phòng bệnh bao gồm chọn lọc cây sạch bệnh để làm giống, vệ sinh đồng ruộng, luân canh cây trồng, thu dọn tàn dư cây bệnh trên đồng ruộng, diệt trừ côn trùng truyền bệnh. Tuy nhiên, các biện pháp trên thường có hiệu quả 2 thấp và tốn nhiều công sức. Biện pháp có hiệu quả nhất để phòng hai loài SMV và BYMV là sử dụng các giống đậu tương kháng bệnh, nhưng nguồn giống đậu tương kháng bệnh tự nhiên đối với SMV và BYMV là rất hạn chế.

Chính vì vậy hướng tiếp cận tạo cây đậu tương chuyển gen kháng virus được quan tâm nghiên cứu, đó là chuyển các gen có nguồn gốc từ chính loài virus gây bệnh theo nguyên lý của kỹ thuật RNA interference (RNAi). RNAi được xem là một kỹ thuật hiện đại và có hiệu quả được ứng dụng để kháng lại các loài virus gây bệnh ở thực vật. Dựa trên nguyên lý bất hoạt gen sau phiên mã, một số tác giả đã ứng dụng thành công kỹ thuật RNAi trong chiến lược tạo cây chuyển gen kháng virus [3], [31], [98]. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Phân lập đoạn gen CP từ Soybean mosaic virus và phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi phục vụ tạo cây đậu tương chuyển gen kháng bệnh”.

Mục tiêu nghiên cứu 2. Mục tiêu chung Tạo được dòng cây chuyển gen kháng virus gây bệnh khảm trên cây đậu tương bằng kỹ thuật RNAi. Mục tiêu cụ thể (i) Xác định được trình tự đoạn gen CP từ SMV gây bệnh khảm ở cây đậu tương Việt Nam. (ii) Phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của SMV và cả hai loài SMV và BYMV.

(iii) Tạo được cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả năng kháng SMV và BYMV cao hơn cây đối chứng không chuyển gen; (iv) Tạo được cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi. Nội dung nghiên cứu 3. Thu thập thông tin về hệ gen và gen CP của SMV, thiết kế cặp mồi và nhân đoạn gen CP, tách dòng và xác định trình tự đoạn gen CP từ SMV. Phân tích sự đa dạng về trình tự đoạn gen CP, trình tự amino acid suy diễn của gen CP phân lập từ SMV ở Việt Nam và một số trình tự đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế.

Phân tích sự tương đồng của gen CP trong hệ gen của SMV và BYMV phân lập từ nhiều nguồn khác nhau. Xác định đoạn bảo thủ của gen CP và tổng hợp nhân tạo đoạn CPi từ thông tin về gen CP. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của SMV và của hai loài SMV và BYMV bằng kỹ thuật Gateway. Biến nạp vector chuyển gen mang đoạn gen CPi đã thiết kế vào A.

Biến nạp cấu trúc RNAi vào cây thuốc lá. Phân tích sự có mặt của đoạn gen CPi của hai loài SMV và BYMV trên cây thuốc lá chuyển gen bằng kỹ thuật PCR. Đánh giá tính kháng đối với SMV và BYMV của cây chuyển gen so với cây đối chứng không chuyển gen. Chuyển cấu trúc RNAi vào cây đậu tương thông qua A.

Phân tích, xác định sự có mặt của đoạn gen chuyển CPi trên cây đậu tương chuyển gen. Những đóng góp mới của luận án 4. Phân lập được đoạn gen CP từ SMV dòng SL1 và SL2 có kích thước 720 nucleotide, mã hóa 240 amino acid. Hai trình tự đoạn gen CP của SMV đã được đăng ký trên Ngân hàng gen quốc tế với mã số HG965102, HG965103.

Phát triển thành công hai vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả năng kháng đơn loài SMV và khả năng kháng đồng thời hai loài SMV và BYMV. Tạo được 19 dòng cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả năng kháng cả hai loài SMV và BYMV. Chuyển thành công cấu trúc RNAi vào hai giống đậu tương ĐT12 và DT2008, thu được 5 dòng cây chuyển gen từ giống ĐT12 và 19 dòng cây chuyển gen từ giống DT2008. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 5.

Về khoa học Việc phát triển thành công vector chuyển gen mang cấu trúc gen RNAi chứa đoạn gen CPi kháng đơn loài SMV và kháng đồng thời cả hai loài SMV, BYMV để tạo được cây thuốc lá chuyển gen có tính kháng đối với SMV và BYMV cao hơn cây đối chứng không chuyển gen đã khẳng định cơ sở khoa học và tính hiệu quả của biện pháp sử dụng các gen có nguồn gốc từ chính loài virus gây bệnh để chuyển vào cây trồng nhằm tạo cây chuyển gen kháng virus theo nguyên lý của kỹ thuật RNAi. Về thực tiễn Kết quả lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp vào mô đậu tương đã tổn thương và tái sinh thành công cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của SMV và BYMV đã cho thấy khả năng ứng dụng kỹ thuật chuyển gen và kỹ thuật RNAi trong chọn tạo giống đậu tương ở Việt Nam. Kết quả thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen CPi của SMV và BYMV theo nguyên lý kỹ thuật RNAi để tạo được cây chuyển gen đối với thuốc lá và đậu tương đã khẳng định hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RNAi và mở ra triển vọng ứng dụng mới trong thực tiễn chọn giống cây trồng ở Việt Nam.

5 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. BỆNH KHẢM DO VIRUS Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG 1. Cây đậu tương và bệnh virus ở cây đậu tương Cây đậu tương có tên khoa học là Glycine max (L. Đậu tương là loại cây trồng quan trọng bởi giá trị dinh dưỡng và giá trị cải tạo đất.

Hạt đậu tương chứa khoảng 40% protein, 20% lipid và chứa nhiều chất quan trọng cho hoạt động sinh lý của cơ thể người và động vật, như: isoflavone, lecithin, tocopherol và saponin. Thêm nữa hạt đậu tương còn chứa nhiều protein chức năng và là nguồn thực phẩm rẻ tiền, có vai trò trong chăm sóc và bảo vệ sức khỏe con người [149], [158]. Các sản phẩm từ đậu tương đã tăng lên đáng kể so với các loại cây trồng khác do nhu cầu về protein và dầu [82]. Cây đậu tương là cây trồng cạn ngắn ngày, lấy hạt và thuộc nhóm cây hàng năm.

Rễ của cây đậu tương là loại rễ cọc, gồm rễ chính và các rễ bên. Rễ tập trung ở tầng đất mặt 30 – 40 cm, ăn lan khoảng 20 – 40 cm. Trên rễ có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum có khả năng cố định đạm [1]. Thân cây đậu tương ít phân cành, cây thảo, dạng bụi, có hình trụ, nhiều lông, mang nhiều đốt, thân thường đứng, có khi dạng bò hay nửa bò.

Cành đậu tương mọc ra từ các đốt trên thân, đốt đầu tiên của thân chính mang hai lá mầm, đốt thứ hai mang hai lá đơn đối nhau, từ đốt thứ ba trở lên mỗi đốt mang một lá kép. Đậu tương là cây tự thụ phấn, hoa lưỡng tính, hoa được phát sinh từ nách lá, đầu cành hoặc đầu thân. Hoa thuộc hoa cánh bướm, mọc thành chùm, có màu tím hay trắng, thời kỳ cây ra hoa sớm hay muộn, thời gian dài hay ngắn tuỳ thuộc vào giống và thời vụ gieo do chịu ảnh hưởng phối hợp của ánh sáng và nhiệt độ [1], [2]. Quả đậu tương là loại quả ráp, bên ngoài vỏ quả thường có lớp lông bao phủ, màu sắc vỏ khi chín có màu vàng hoặc xám đen.

Quả thẳng 6 hoặc hơi cong. Mỗi quả thường có từ 1 - 4 hạt nhưng phổ biến là 2 hạt. Hạt đậu tương có nhiều hình dạng như bầu dục, tròn dài, tròn dẹt. Vỏ hạt thường nhẵn và có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, đen… nhưng đa số là hạt màu vàng.

Khối lượng hạt dao động từ 200 – 400 mg/hạt và khối lượng 1000 hạt dao động trung bình 100-200g. Hình dạng và màu sắc rốn hạt là dấu hiệu đặc trưng cho mỗi giống đậu tương [1], [2]. Với những giá trị kinh tế và giá trị sử dụng, đậu tương được xem là loại cây trồng chiến lược của nhiều quốc gia trên thế giới, với vị trí đứng thứ tư chỉ sau lúa, ngô và lúa mỳ. Ở Việt Nam, cây đậu tương được trồng từ rất lâu và nhu cầu tiêu thụ đậu tương cũng rất lớn, nên sản xuất đậu tương trong nước đang được chú trọng, diện tích gieo trồng vì thế đã tăng lên đáng kể.