Luận án tiến sĩ nhân dòng biểu hiện và nghiên cứu một số tính chất của protease

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TƢ̣ NHIÊN Nguyễn Thị Hồng Loan NHÂN DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE TỪ HIV-1 TẠI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH SINH HỌC 1 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Virus gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời (Human immunodeficiency virus - HIV) là nguyên nhân chính gây ra hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở ngƣời (AIDS) và là một trong số những virus gây bệnh nghiêm trọng nhất hiện nay. HIV biến đổi liên tục về cấu trúc và hệ gen để kháng lại các thuốc điều trị và gây ra tỷ lệ tử vong cao. Kể từ khi xuất hiện (từ năm 1981) đến nay đã có khoảng 60 triệu ngƣời trên hành tinh bị nhiễm HIV, trong đó có khoảng 25 triệu ngƣời đã chết do các bệnh có liên quan đến AIDS và AIDS đã trở thành một trong những căn bệnh gây chết nhiều ngƣời nhất trong lịch sử loài ngƣời (UNAIDS, 2010).

Theo các tài liệu đã công bố, có ít nhất hai type HIV gây nên AIDS đó là HIV type 1 (HIV-1) và HIV type 2 (HIV-2), nhƣng HIV-1 là nguyên nhân chính gây ra AIDS ở ngƣời trên toàn thế giới. Trong chu trình sống của HIV-1, 3 enzyme reverse transriptase, integrase và protease có vai trò quan trọng không thể thiếu trong sao chép, đóng gói và hình thành virus hoàn chỉnh. Vì vậy, các chất ức chế của 3 enzyme này đã đƣợc nghiên cứu, sản xuất để điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS và các điều trị này đƣợc gọi là liệu pháp dùng thuốc chống retrovirus (antiretroviral drug therapy, gọi tắt là ART). Trong số 3 enzyme nói trên, protease đƣợc mã hóa bởi gen pol của virus có chức năng cắt các chuỗi polyprotein (gag, gag-pol) tại những vị trí nhất định để tạo thành các protein cấu trúc và chức năng cần thiết cho virus hoàn chỉnh.

Nếu protease bị mất hoạt tính, HIV-1 không đƣợc đóng gói phù hợp để tạo virus hoàn chỉnh (Darke và tập thể, 1989). Tuy nhiên, do tốc độ sinh sản nhanh của HIV – 1, có khoảng 10 triệu hạt virus mới đƣợc tạo ra mỗi ngày và tỷ lệ sai sót rất cao của enzyme reverse transriptase (1/10.000 base) dẫn đến tình trạng kháng thuốc phổ biến ở những bệnh nhân nhiễm bệnh thậm chí khi chƣa điều trị. Khi có ART, các chủng mang đột biến kháng thuốc đƣợc chọn lọc và trở thành chủng ƣu thế (Hoffmann và tập thể, 2007). Mặc dầu, ngày càng có nhiều chất ức chế protease (PI) chống HIV đƣợc phát triển và thƣơng mại hóa nhƣng hiện vẫn chƣa tìm đƣợc chất ức chế nào thực sự có hiệu quả.

Vì vậy, việc sản xuất và tinh sạch để thu đƣợc lƣợng lớn 2 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com protease của HIV-1 cho các nghiên cứu điều tra, phát triển chất ức chế hiệu quả là cần thiết. Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu để sản xuất protease của HIV-1 (đƣợc gọi tắt là protease HIV-1) nhƣng thực tế cho thấy protease HIV-1 không dễ dàng đƣợc biểu hiện trong tế bào vật chủ do đặc tính gây độc tế bào, khó tan; lƣợng protease thu đƣợc sau biểu hiện thƣờng thấp, trong một số trƣờng hợp chỉ có thể phát hiện đƣợc bằng phƣơng pháp miễn dịch với các quy trình biểu hiện, tinh sạch gồm nhiều bƣớc rất phức tạp. Mặt khác, các nghiên cứu đều sản xuất protease HIV-1 phân lập từ phân nhóm B là phân nhóm HIV phổ biến gây bệnh ở Mỹ, Australia và các nƣớc Tây Âu. Trong khi, phần lớn các trƣờng hợp nhiễm HIV-1 trên thế giới và ở Việt Nam không thuộc phân nhóm B.

Những nghiên cứu gần đây cho thấy sự khác nhau về cấu trúc của protease phân nhóm B so với các phân nhóm khác dẫn đến hiệu quả điều trị thuốc ức chế protease (PI) và mức độ kháng thuốc có thể khác nhau. Chính vì vậy, thiết lập hệ thống biểu hiện và tinh sạch protease HIV-1 tái tổ hợp hiệu quả và đại diện cho phân nhóm HIV-1 gây bệnh chủ yếu ở Việt Nam có vai trò quan trọng trong việc nâng cao hiệu quả điều trị bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS. Bên cạnh đó, các đột biến kháng PI tƣơng đối đặc hiệu cho từng loại thuốc riêng biệt, do đó thay thế một loại thuốc khác trƣớc khi có sự tích lũy đột biến thì các phác đồ sau vẫn thành công (Hoffmann và tập thể, 2007). Vì vậy, xét nghiệm kháng thuốc thƣờng theo hƣớng phát hiện đột biến trong gen mã hóa protease HIV-1 có vai trò rất quan trọng trong việc xây dựng phác đồ điều trị HIV/AIDS.

Ở Việt Nam, protease HIV-1 từ các bệnh nhân Việt Nam là vấn đề còn ít đƣợc nghiên cứu. Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào xác định nhóm virus gây bệnh chủ yếu ở ngƣời Việt Nam và tìm ra một số đột biến liên quan kháng thuốc. Đặc biệt, chƣa có nghiên cứu nào về biểu hiện protease HIV-1 phân lập từ các bệnh nhân ngƣời Việt Nam. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nhân dòng, biểu hiện và nghiên cứu một số tính chất của protease từ HIV-1 tại Việt Nam” để tạo ra chế phẩm protease HIV-1 tái tổ hợp sử dụng cho mục đích sàng lọc và phát 3 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com triển các chất ức chế sự nhân lên của HIV, từng bƣớc làm cơ sở phát triển thuốc điều trị HIV/AIDS.

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài - Phát hiện một số đột biến trong gen mã hóa protease HIV-1 ở ngƣời Việt Nam. - Thiết lập quy trình hiệu quả cho việc biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 ở vi khuẩn E. coli và tinh sạch protease HIV-1 tái tổ hợp ở dạng có hoạt tính. - Nghiên cứu một số tính chất protease HIV-1 và tìm hiểu tác dụng của một số chất ức chế làm cơ sở để tìm kiếm và phát triển các PI mới có thể ứng dụng trong điều trị HIV/AIDS.

Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu của đề tài Đối tượng nghiên cứu của đề tài: Gen mã hóa protease HIV-1 từ huyết thanh các bệnh nhân nhiễm HIV-1 tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ƣơng. Nội dung nghiên cứu của đề tài: - Tinh sạch RNA của HIV-1 và tổng hợp cDNA của một số mẫu HIV-1 từ các bệnh nhân nhiễm HIV-1 tại Việt Nam. - Nhân bản, nhân dòng và đọc trình tự gen mã hóa protease HIV-1 của các mẫu virus phân lập đƣợc, đánh giá sự sai khác về trình tự gen mã hóa protease HIV-1 giữa các đối tƣợng bệnh nhân nhiễm HIV-1 so với trình tự gen tƣơng ứng trên thế giới. - Thiết kế hệ thống vector và xác định điều kiện biểu hiện gen mã hóa cho protease HIV-1 ở E.

- Xây dựng quy trình tinh sạch protease HIV-1 tái tổ hợp. - Nghiên cứu một số đặc trƣng xúc tác của protease HIV-1 tái tổ hợp thu đƣợc. - Tìm hiểu tác dụng ức chế của một số hợp chất tổng hợp và tự nhiên lên protease HIV-1 tái tổ hợp. Địa điểm thực hiện đề tài Các nghiên cứu của luận án đƣợc thực hiện chủ yếu tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

Đóng góp mới của đề tài 4 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com - Công trình nghiên cứu có tính hệ thống từ việc nhân bản, nhân dòng và biểu hiện ở E. coli gen mã hóa protease HIV-1 tái tổ hợp thuộc chủng CRF01_AE của Việt Nam; thiết lập đƣợc phƣơng pháp đơn giản để tinh sạch protease HIV-1 với hiệu suất thu nhận enzyme cao hơn so với các nghiên cứu trên thế giới. - Là công trình đầu tiên phát hiện thấy tác dụng ức chế protease HIV-1 bởi axit asiatic, 8-hydroxyquinoline và menadione. Ứng dụng thực tiễn của đề tài - Cách thức biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 và tinh sạch protease tái tổ hợp tạo ra trong công trình nghiên cứu này có thể dễ dàng đƣợc áp dụng để sản xuất một số protease tái tổ hợp khó tan và chỉ đặc hiệu với một số cơ chất nhất định.

- Chế phẩm protease HIV-1 tạo ra là cơ sở cho việc tìm kiếm và phát triển các PI mới để có thể ứng dụng trong điều trị bệnh nhân HIV/AIDS. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ HIV-1 1. HIV-1 nguyên nhân của AIDS Virus gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời (HIV) lần đầu tiên đƣợc Montagnier và tập thể ở Viện Pasteur Paris phân lập vào năm 1983 với tên gọi ban đầu là virus liên quan tới viêm hạch (LAV).

Năm 1986, virus này đƣợc Ủy ban Quốc tế thống nhất gọi tên HIV (Greene, 2007). Cùng thời điểm đó ngƣời ta đã phân lập đƣợc một virus mới ở Tây Phi và đặt tên là HIV–type 2, đây là virus gốc của HIV-type 1. Hai loại virus này đều làm suy giảm hệ thống miễn dịch của ngƣời và đặt tên chung là HIV. Mặc dù HIV-type 2 có một số điểm giống với HIV-type 1 nhƣ về cách thức 5 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com truyền bệnh, các hình thức nhiễm bệnh cơ hội và phƣơng pháp điều trị nhƣng ngƣời nhiễm HIV-type 2 ít phát sinh bệnh hơn so với nhiễm HIV-type 1 và HIV-type 2 thấy chủ yếu ở các vùng của Châu Phi (Hoffmann và tập thể, 2007).

Vì vậy, HIV- type 1 (HIV-1) đƣợc xem nhƣ là nguyên nhân chính gây nên bệnh AIDS. HIV thuộc họ retrovirus, là họ gây ung thƣ cho ngƣời và động vật. HIV-1 có 3 nhóm chính là M (main), N (new), và O (outlier). Có tới 90% sự lây nhiễm HIV trên toàn thế giới thuộc nhóm M; nhóm này có 9 phân type đƣợc ký hiệu bằng các chữ cái A-D, F-H, J, K và nhiều dạng tái tổ hợp khác đƣợc gọi tắt là các phân nhóm CRF (circulating recombinant forms).

Sự khác nhau giữa phân nhóm này với phân nhóm khác là ở trình tự axit amin của protein vỏ và có thể vƣợt quá 30%. Phân nhóm B phổ biến ở Mỹ, Tây Âu và Australia; trong khi các phân nhóm không phải nhóm B lại phân bố ở các nƣớc đang phát triển của châu Á và châu Phi, nơi mà phần lớn những ngƣời bị nhiễm đang sinh sống. Sự đa dạng của virus có thể thấy ở vùng Sahara (châu Phi). Ở Việt Nam và các nƣớc Đông Nam Á phân nhóm HIV-1 phân lập từ các bệnh nhân nhiễm HIV-1 chủ yếu thuộc nhóm CRF01_AE, bên cạnh đó là một số ít các phân nhóm B, C và các dạng tái tổ hợp khác (UNAIDS, 2010; Nguyen và tập thể, 2003; Ishizaki và tập thể, 2009; Phan và tập thể, 2010).

Phần lớn việc nghiên cứu để tìm ra thuốc điều trị bệnh do HIV gây nên đều dựa trên phân nhóm B.