Luận án: Nghiên cứu vật liệu polyme thân thiện môi trường ứng dụng trong chế tạo bầu ươm

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 13 C-NMR : Carbon Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon) 1 H-1H-COSY : 1H-1H Correlated Spectroscopy (Phổ tương tác proton-proton) 1 H-NMR : Proton Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton) 7-MCPA : 7-methoxy-(9H-b-carbolin-1-il)-(E)-1-propenoic acid ATCC Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ CĐHST : Chất điều hòa sinh trưởng thực vật Chất (1) : 7-MCPA Chất (2) : 9-methoxycanthin-6-one Chất (3) : 9-hydroxycanthin-6-one d : Dublet dd : Dublet của dublet DEPT : Distortionless Enhancement By polarization Transfer (Phổ DEPT) ĐK-Bb : Xây dựng phương pháp phân tích mẫu Bá bệnh bằng HPLC DMSO : Dimethyl sulfoxyde dq : Dublet của quartet dt : Dublet của triplet HepG2 : Dòng tế bào ung thư gan HPLC : High performance liquid chromatography (sắc ký lỏng hiệu năng cao) HSQC : Heteronuclear Spectroscopy Quantum Coherence (Phổ tương tác dị hạt nhân) IC50 : Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của cá thể nghiên cứu J(Hz) : Hằng số tương tác tính bằng Hz JA : Jasmonic acid KB : Dòng tế bào ung thư biểu mô vi KLK : Khối lượng khô KLT : Khối lượng tươi LPS : Escherichia coli 055:B5 LPS : Lipopolysaccharide LU-1 : Dòng tế bào ung thư phổi m : Multiplet MCF-7 : Dòng tế bào ung thư vú MS : Môi trường Murashige và Skoog – 1962 MS : Murashige & Skoog, 1962 MTT : (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân PBS : Huyết thanh bò (fetal bovine serum) q : Quartet Rễ TN : Rễ tự nhiên S : singulet SA : Salicylic acid SH : Môi trường Schenk và Hildebrandt - 1972 SH : Schenk and Hidebrandt, 1972 t : Triplet TCA : Acid tricloacetic TLC : Thin layer chromatography (sắc ký lớp mỏng) Trypsin EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid WPM : Môi trường McCown’s Woody Plant - 1981 WPM : McCown’s Woody Plant, 1981 YE : Yeast extract (dịch chiết nấm men) δ (ppm) : Độ chuyển dịch hóa học tính bằng ppm vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Các thành phần hoá học được phân lập từ cây Bá bệnh và tác dụng dược lý của chúng.2 Sản xuất hợp chất thứ cấp bằng kỹ thuật nuôi cấy rễ tơ từ một số loài cây thuốc. Kết quả thử hoạt tính độc tế bào ung thư của các chất thử (1), (2), (3). Kết quả xác định nồng độ ức chế sản xuất 50 % IL-6 và TNF-α của tế bào.

Kết quả xây dựng đường chuẩn ba alkaloid (1), (2), (3). Sự phát triển của rễ tơ Bá bệnh trên môi trường lỏng và thạch.5 Sự phát triển của rễ tơ ở điều kiện tối và sáng. Ảnh hưởng chiều dài rễ cấy chuyển đến sinh trưởng và phát triển của rễ tơ. Sự phát triển của rễ tơ trên 100 ml môi trường.

Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến sinh trưởng và phát triển của rễ tơ. Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến tích luỹ chất 7MCPA. Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến tích luỹ 9- methoxycanthin-6-one. Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến tích luỹ chất 9- hdroxycanthin-6-one.

Ảnh hưởng của JA lên sự sinh trưởng và tích luỹ các alkaloid của rễ tơ cây Bá bệnh. Ảnh hưởng của SA lên sự sinh trưởng và tích luỹ các alkaloid của rễ tơ cây Bá bệnh. Ảnh hưởng của YE lên sự sinh trưởng và tích luỹ các alkaloid của rễ tơ cây Bá bệnh. Hiệu quả tác động của các elicitor lên tích luỹ các alkaloid.

Kết quả sau 30 ngày nuôi cấy rễ tơ trên hệ thống bioreactor tự tạo 20 lít. Hàm lượng alkaloid có trong rễ tơ và rễ tự nhiên. 87 ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình thái cây Bá bệnh.2 Minh hoạ một số sản phẩm được sản xuất từ cây Bá bênh .3 Hệ thống bioreactor sủi bọt dạng cầu .4 Cơ chế tác động lên tế bào của elicitor .5 Sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh 90 g .1 Rễ tơ nuôi cấy trên môi trường WPM .2 Rễ tơ cây Bá bệnh nuôi cấy trên môi trường WPM .3 Quy trình chiết cao alkaloid từ sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh .4 Sơ đồ phân lập các chất từ cao chiết alkaloid .5 Mô phỏng các bộ phận của hệ thống bioreactor 20 lít sủi bọt 42 dạng cầu tự tạo .1 Sắc ký cột và sắc ký bản mỏng một số phân đoạn cao chiết 43 alkaloid .2 Sắc ký bản mỏng của chất (1), (2), (3) phân lập được từ cao chiết 47 methanol của rễ tơ cây Bá bệnh .4 Ảnh hưởng của chất 7-MCPA trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7.5 Ảnh hưởng của chất 9-methoxycanthin-6-one trên dòng tế bào 49 ung thư vú MCF-7 .5 Kết quả ảnh hưởng của chất (1), (2), (3) lên sự sống của tế bào đại thực bào chuột và người .6 Chất 7-MCPA ức chế sản xuất IL-6 và TNF-α trên tế bào đại thực vào chuột và người được kích hoạt bởi LPS .7 Chất 9-methoxycanthin-6-one ức chế sản xuất IL-6 và TNF-α trên tế bào đại thực vào chuột và người được kích hoạt bởi LPS.8 Chất 9-hydroxycanthin-6-one ức chế sản xuất IL-6 và TNF-α trên tế bào đại thực bào chuột và người được kích hoạt bởi LPS 53 Hình 3.9 Sắc ký đồ của các chất chuẩn (1), (2), (3),.10 Đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic với nồng độ chất chuẩn .11 Sự phát triển của rễ tơ trên môi trường lỏng và thạch .12 Sự phát triển của rễ tơ ở điều kiện tối và sáng .13 Quá trình mọc đầu sinh trưởng của các đoạn rễ tơ được cắt với kích thước khác nhau .14 Ảnh hưởng chiều dài rễ cấy chuyển đến sinh trưởng và phát triển của rễ tơ .15 Sự phát triển của rễ tơ trên 100 ml môi trường với lượng rễ ban đầu khác nhau.16 Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến sinh trưởng và phát triển của rễ tơ .17 Sắc ký HPLC của rễ tơ được nuôi cấy trên môi trường WP .18 Ảnh hưởng của JA lên sự sinh trưởng và tích luỹ các alkaloid của rễ tơ Bá bệnh .19 Sắc ký HPLC thể hiện hàm lượng alkaloid trong có trong rễ tơ nuôi cấy trên môi trường WPM bổ sung 8 mg/l JA .20 Ảnh hưởng của SA lên sự sinh trưởng và tích luỹ các alkaloid của rễ tơ Bá bệnh .21 Sắc ký HPLC thể hiện hàm lượng các alkaloid có trong rễ tơ nuôi cấy trên môi trường WPM bổ sung 5 mg/l SA.22 Ảnh hưởng của dịch chiết nấm men lên sự sinh trưởng và tích luỹ các alkaloid của rễ tơ cây Bá bệnh.23 Sắc ký HPLC thể hiện hàm lượng alkaloid của mẫu rễ tơ nuôi cấy trên môi trường WPM bổ sung 40 mg/l YE .24 Nguồn mẫu ban đầu….25 Chuẩn bị bình nuôi cấy bioreactor 20 lít .26 Bình thuỷ tinh 20 lít chứa 9,8 lít môi trường .27 Chuyển môi trường vào bình bioreactor 20 lít .28 Quy trình nuôi cấy rễ tơ trên hệ thống Bioreactor 20 lít .29 Nuôi cấy rễ tơ trên hệ thống bioreactor 20 lít .30 Hàm lượng các alkaloid tích luỹ trong rễ tơ và ở rễ tự nhiên .31 Sắc ký bản mỏng các alkaloid, cao chiết tổng MeOH của rễ tơ 88 và rễ TN cây Bá bệnh.32 (A) và (B) Sắc ký HPLC của mẫu rễ tơ được nuôi cấy trên hệ thống bioreactor 20 lít và rễ tự nhiên cây Bá bệnh. 89 xii MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài Cây Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) là cây thuốc phổ biến ở nước ta, phân bố chủ yếu ở các tỉnh miền Trung, Kon tum, Đồng Nai, Phú Quốc và Vườn quốc gia Bái Tử Long.

Cây Bá bệnh được dùng bồi bổ sức khoẻ, tăng lượng testosterone ở nam giới, có hoạt tính kháng viêm mạnh, chống ung thư tốt và một số tác dụng khác như chữa sốt rét, chống loãng xương, trị tiểu đường.Các công trình nghiên cứu về cây Bá bệnh cho thấy cây có chứa nhiều hoạt chất alkaloid có giá trị trong kháng sốt rét, chống viêm, gây độc tế bào ung thư và tăng cường sinh lực… Hiện nay, cây Bá bệnh đang bị khai thác quá mức ngoài tự nhiên do nhu cầu sử dụng thảo dược ngày càng tăng. Hơn nữa, Bá bệnh khó nuôi trồng và nhân rộng, với thời gian thu hoạch được rễ có chất lượng phải cần ít nhất 5-6 năm dẫn tới nguồn nguyên liệu cung cấp cho sản xuất dược phẩm còn gặp nhiều khó khăn. Đến nay, nuôi cấy rễ được xem là một giải pháp thay thế đầy tiềm năng để thu nhận ổn định được một lượng lớn sinh khối sạch trong thời gian ngắn từ 30-40 ngày, làm nguồn nguyên liệu cho sản xuất dược liệu. Công nghệ nuôi cấy mô sẹo hay nuôi cấy huyền phù tế bào cần phải bổ sung chất điều hoà sinh trưởng (CĐHST).

Tuy nhiên, sự tồn dư CĐHST ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ người sử dụng. Vấn đề này có thể khắc phục trong nuôi cấy sinh khối rễ tơ do rễ tơ có thể sinh trưởng và phát triển liên tục không cần bổ sung CĐHST. Hơn thế, rễ tơ có nhiều ưu điểm khác như có thể sản xuất một lượng lớn các hợp chất thứ cấp và có sự di truyền ổn định hơn nuôi cấy tế bào huyền phù và mô sẹo. Trong nuôi cấy in vitro, việc gây kích kháng hay bổ sung các elicitor giúp tăng đáng kể khả năng tích lũy các hợp chất thứ cấp trong quá trình nhân nhanh sinh khối rễ.

Nuôi cấy rễ tơ cây Bá bệnh in vitro, dù môi trường giàu dinh dưỡng giúp rễ phát triển nhanh, nhưng hàm lượng alkaloid phân tích được rất thấp. Hơn nữa, quá trình tích lũy một số chất không diễn ra do thiếu một số yếu tố kích kháng, dẫn đến hàm lượng alkaloid nội sinh thấp hơn so với rễ thu ngoài tự nhiên. Kể từ khi các stress do sự thay đổi về ánh sáng, nhiệt độ hay tác động từ các tác nhân gây hại cây trồng được phát hiện làm kích thích tích lũy các hợp chất thứ cấp thông qua con đường truyền tín hiệu của các elicitor như jasmonic acid (JA), salicylic 1 acid (SA), yeast extract (YE)… lần lượt kích hoạt biểu hiện các gen phòng vệ, đồng thời sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp. Các elicitor đã được ứng dụng rộng rãi vào nuôi cấy để gia tăng hoạt chất saponin trong nuôi cấy nhiều loài cây dược liệu quý.

Việc nghiên cứu bổ sung các elicitor trong việc tăng cường khả năng tích lũy các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy in vitro vẫn chưa có. Kỹ thuật nuôi cấy mô ra đời đã mở ra một cuộc cách mạng trong nhân giống thực vật. Nhưng với phương pháp truyền thống nuôi cấy trên môi trường thạch thì khó đáp ứng được nhu cầu giống cây trồng cung cấp trên thị trường, giá thành lại cao; do việc phải cấy chuyền, tách mẫu bên trong tủ cấy hầu như đều thực hiện bằng tay, tốn nhiều lao động lại dễ bị nhiễm.