Luận án tiến sĩ: Phân tích kháng sinh nhóm fluoroquinolon trong huyết tương và nước tiểu bằng phương pháp HPLC - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

Kháng sinh fluoroquinolon bao gồm ciprofloxacin, levofloxacin, norfloxacin và moxifloxacin. Các chất này có cấu trúc khung quinolon gắn nguyên tử fluor tại vị trí C-6. Cấu trúc này làm tăng khả năng thâm nhập vào tế bào vi khuẩn. Kháng sinh tác động trực tiếp lên enzym ADN gyrase ở vi khuẩn gram âm. Thuốc ức chế enzym topoisomerase IV ở vi khuẩn gram dương. Quá trình tổng hợp acid nucleic bị đình trệ hoàn toàn. Vi khuẩn ngừng phân chia và nhanh chóng bị tiêu diệt. Ngoài ra thuốc còn gây ức chế tổng hợp mARN của vi khuẩn. Tuy vậy, lạm dụng thuốc dễ dẫn đến đột biến gen đề kháng. Một số trường hợp ghi nhận tác dụng phụ trên gân và hệ thần kinh trung ương. Vì vậy, việc theo dõi nồng độ thuốc tự do trong cơ thể người bệnh là bắt buộc.

Kiểm soát nồng độ thuốc trong máu giúp đảm bảo hiệu quả diệt khuẩn tối đa. Nồng độ thuốc dưới ngưỡng điều trị sẽ làm gia tăng nguy cơ kháng kháng sinh. Ngược lại, nồng độ quá cao sẽ gây độc tính nghiêm trọng cho gan và thận. Mỗi cá thể người bệnh có khả năng hấp thu và chuyển hóa thuốc khác nhau. Bệnh nhân suy giảm chức năng thận cần điều chỉnh liều ciprofloxacin và levofloxacin phù hợp. Mối tương quan giữa diện tích dưới đường cong nồng độ và nồng độ ức chế tối thiểu quyết định thành công điều trị. Phân tích dịch sinh học cung cấp thông số dược động học chính xác của từng bệnh nhân. Kết quả xét nghiệm định lượng hỗ trợ bác sĩ đưa ra phác đồ cá thể hóa. Giám sát điều trị bằng phương pháp phân tích chuẩn xác là tiêu chuẩn trong các bệnh viện hiện đại.

Mẫu sinh học như huyết tương và nước tiểu có nền mẫu rất phức tạp. Protein huyết tương liên kết mạnh với các phân tử fluoroquinolon. Nước tiểu chứa nhiều muối vô cơ, sắc tố mật và chất chuyển hóa bài tiết. Các phân tử quinolon có tính chất lưỡng tính acid-base phức tạp. Phân tử tồn tại ở nhiều dạng ion hóa khác nhau tùy theo pH môi trường. Hiện tượng tạo phức chelate với các ion kim loại đa hóa trị thường xuyên xảy ra. Điều này gây khó khăn cho quá trình chiết tách và lưu giữ sắc ký. Ngoài ra, nồng độ vết của thuốc trong mẫu thử đòi hỏi phương pháp có độ nhạy rất cao. Hệ thống phân tích phải loại bỏ triệt để chất gây nhiễu để tránh sai số đo quang học. Phương pháp sắc ký cần tối ưu hóa toàn diện từ xử lý mẫu đến phát hiện tín hiệu.

Methanol và acid trichloroacetic (TCA) 20% là hai tác nhân kết tủa protein phổ biến. Methanol làm biến tính protein bằng cách thay đổi hằng số điện môi của môi trường. Phương pháp dùng methanol cho dịch chiết sạch, ít ảnh hưởng đến pH của pha động sắc ký. Mẫu sau khi tủa bằng methanol có thể tiêm trực tiếp lên cột phân tích. Trong khi đó, TCA phá vỡ cấu trúc bậc ba của protein nhờ tính acid mạnh. Tủa tạo thành bởi TCA thường rất chặt và dễ lắng hoàn toàn khi ly tâm. Tuy nhiên, lượng acid dư thừa có thể làm giảm độ bền của cột sắc ký pha đảo C18. Nồng độ acid cao cũng làm thay đổi trạng thái ion hóa của các chất phân tích. Thực nghiệm cho thấy methanol 100% đem lại độ tái lặp diện tích pic và độ thu hồi đồng đều hơn.

Quy trình xác định ciprofloxacin trong huyết tương người bắt đầu từ bước rã đông mẫu. Lấy chính xác 200 microlit huyết tương cho vào ống ly tâm eppendorf. Thêm chuẩn nội thích hợp để kiểm soát sai số trong toàn bộ quy trình. Bổ sung tiếp 400 microlit methanol tuyệt đối để tiến hành kết tủa protein. Hỗn hợp được trộn xoáy vortex liên tục trong vòng hai phút để phản ứng xảy ra hoàn toàn. Ly tâm ống mẫu ở tốc độ 12000 vòng trên phút trong mười phút ở bốn độ C. Hút lấy phần dịch nổi trong suốt chuyển sang lọ đựng mẫu tự động. Dung dịch được lọc qua màng lọc PTFE kích thước 0,22 micromet trước khi tiêm vào hệ thống sắc ký. Đường chuẩn tuyến tính của ciprofloxacin được xây dựng trong khoảng nồng độ điều trị lâm sàng.

Khảo sát phân tích moxifloxacin HPLC trong huyết tương đòi hỏi tối ưu tỷ lệ dung môi kết tủa. Tỷ lệ thể tích giữa huyết tương và methanol được khảo sát từ 1:1 đến 1:4. Tỷ lệ 1:2 cho thấy khả năng loại bỏ protein trên 98% mà không làm loãng mẫu quá mức. Hiệu suất thu hồi của moxifloxacin đạt trên 85% với độ lệch chuẩn tương đối dưới 5%. Quá trình bay hơi dung môi và hòa tan lại cắn bằng pha động giúp làm giàu nồng độ chất phân tích. Thao tác này cải thiện đáng kể giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp. Sắc ký đồ mẫu huyết tương sau xử lý không xuất hiện pic tạp tại thời gian lưu của moxifloxacin. Phương pháp xử lý mẫu chứng minh độ chọn lọc cao và độ ổn định tốt trong các điều kiện bảo quản khác nhau.

Phương pháp chiết lỏng lỏng sử dụng dung môi hữu cơ không trộn lẫn như dicloromethan hoặc ethyl acetat. Kỹ thuật này dễ gây hiện tượng nhũ tương hóa khó tách lớp với mẫu nước tiểu. Thể tích dung môi tiêu hao lớn gây ô nhiễm môi trường và tốn thời gian bay hơi. Ngược lại, kỹ thuật chiết pha rắn SPE cố định chất phân tích trên pha rắn bằng tương tác hóa lý. Các chất phân cực và tạp chất vô cơ bị rửa trôi dễ dàng bằng nước hoặc dung dịch đệm loãng. Dung môi hữu cơ giải hấp thu chỉ cần sử dụng với một thể tích rất nhỏ. Hiệu suất thu hồi của SPE thường cao hơn và ổn định hơn từ 15% đến 20% so với chiết lỏng lỏng. Các cột SPE đồng đều giúp hạn chế tối đa sai số thao tác giữa các mẻ phân tích khác nhau.

Quy trình xác định levofloxacin trong nước tiểu sử dụng cột chiết pha rắn C18 dung tích 3 mililit. Cột SPE được hoạt hóa tuần tự bằng 2 mililit methanol và 2 mililit nước cất hai lần. Mẫu nước tiểu được pha loãng với đệm phosphat pH 3,0 theo tỷ lệ 1:1 trước khi nạp lên cột. Mẫu chảy qua cột dưới áp suất hút chân không nhẹ với tốc độ khoảng 1 mililit trên phút. Rửa sạch tạp chất bám yếu bằng 2 mililit dung dịch đệm loãng chứa 5% methanol. Kháng sinh levofloxacin được rửa giải hoàn toàn bằng 1,5 mililit dung dịch methanol chứa 0,1% acid formic. Dịch rửa giải được thổi khô dưới dòng khí nitơ tinh khiết ở nhiệt độ 40 độ C. Cắn thu được hòa tan lại trong 200 microlit pha động trước khi tiêm vào hệ thống phân tích.

Độ sạch của dịch chiết sau SPE được kiểm tra qua sự suy giảm tín hiệu đường nền sắc ký. Hiệu ứng nền mẫu được đánh giá bằng cách so sánh tín hiệu mẫu thêm chuẩn với dung dịch chuẩn trong dung môi. Kỹ thuật chiết pha rắn loại bỏ trên 95% các chất màu và hợp chất hữu cơ gây tắt huỳnh quang. Sắc ký đồ nước tiểu sau chiết SPE cho đường nền phẳng, không có pic tạp chồng lấn pic phân tích. Độ thu hồi của các chất phân tích đạt từ 90% đến 102% tại các mức nồng độ khảo sát. Tỷ lệ suy giảm tín hiệu do hiệu ứng nền mẫu giảm xuống dưới mức 5%. Điều này đảm bảo độ đúng và độ chính xác cao cho các phép định lượng fluoroquinolon trong dịch sinh học.

Cột sắc ký pha đảo C18 với pha tĩnh silica gắn nhóm octadecylsilan biến tính được lựa chọn phổ biến nhất. Các dòng cột C18 có độ bao phủ silanol cao giúp hạn chế tương tác thứ cấp gây giãn rộng pic. Kích thước hạt nhồi 5 micromet hoặc 3 micromet mang lại số đĩa lý thuyết cao và áp suất vừa phải. Chiều dài cột 150 milimet hoặc 250 milimet cung cấp khả năng tách sắc ký tối ưu cho bốn chất fluoroquinolon. Nhiệt độ cột sắc ký được duy trì ổn định ở mức 30 độ C hoặc 35 độ C bằng buồng điều nhiệt. Việc gia nhiệt cột giúp làm giảm độ nhớt của pha động và tăng tốc độ truyền khối của chất phân tích. Nhờ đó, thời gian lưu của các pic sắc ký có độ lặp lại cao với độ lệch chuẩn rất thấp.

Pha động thường bao gồm hỗn hợp dung môi hữu cơ methanol hoặc acetonitril kết hợp với dung dịch đệm phosphat. Nồng độ đệm acid phosphoric và muối phosphat từ 0,02 M đến 0,05 M giúp duy trì lực ion ổn định. Giá trị pH của pha động ảnh hưởng quyết định đến mức độ ion hóa của các phân tử kháng sinh. Khảo sát khoảng pH từ 2,5 đến 4,0 cho thấy pH 3,0 giúp các phân tử fluoroquinolon tồn tại chủ yếu ở dạng cation. Dạng cation giảm thiểu tương tác ion bất lợi với pha tĩnh và cho pic sắc ký sắc nhọn. Tỷ lệ dung môi hữu cơ được điều chỉnh cẩn thận để cân bằng giữa thời gian lưu và độ phân giải giữa các pic. Tốc độ dòng pha động 1,0 mililit trên phút mang lại hiệu quả phân tách lý tưởng.

Rửa giải đẳng dòng gặp khó khăn khi phân tích đồng thời các fluoroquinolon có độ phân cực khác nhau đáng kể. Moxifloxacin giữ lại rất chặt trên pha tĩnh trong khi lomefloxacin và fleroxacin rửa giải ra rất nhanh. Chương trình rửa giải gradient nồng độ methanol được thiết lập để giải quyết vấn đề này. Ban đầu tỷ lệ methanol được giữ ở mức 20% trong hai phút đầu để tách các chất phân cực cao. Sau đó tỷ lệ methanol tăng tuyến tính lên 55% trong vòng mười phút tiếp theo để rửa giải ciprofloxacin và moxifloxacin. Cuối cùng hệ thống tái cân bằng về tỷ lệ ban đầu trong năm phút trước lần tiêm mẫu kế tiếp. Phương pháp gradient giúp rút ngắn tổng thời gian phân tích xuống dưới mười lăm phút mà vẫn đảm bảo độ phân giải tách trên 1,5.

Detector huỳnh quang FLD yêu cầu thiết lập chính xác cặp bước sóng kích thích và phát xạ đặc trưng. Đối với levofloxacin và moxifloxacin, bước sóng kích thích tối ưu là 290 nanomet và phát xạ tại 500 nanomet. Đối với ciprofloxacin và norfloxacin, cặp bước sóng nhạy nhất là kích thích 280 nanomet và phát xạ 445 nanomet. Hệ thống HPLC hiện đại cho phép lập trình chuyển đổi bước sóng tự động theo thời gian lưu sắc ký. Khi pic norfloxacin và ciprofloxacin chuẩn bị xuất hiện, detector tự động chuyển sang cặp bước sóng 280/445 nanomet. Sau đó máy chuyển sang 290/500 nanomet để ghi nhận tín hiệu của levofloxacin và moxifloxacin. Việc lập trình chuyển bước sóng giúp tối đa hóa độ nhạy phát hiện cho tất cả các hoạt chất trong cùng một lần tiêm.

Đầu dò mảng đi-ốt DAD cung cấp khả năng thu nhận đồng thời tín hiệu tại nhiều bước sóng khác nhau từ 190 đến 400 nanomet. Các kháng sinh fluoroquinolon đều có các đỉnh hấp thụ tử ngoại đặc trưng tại vùng 280 đến 330 nanomet. Đầu dò DAD so sánh phổ UV thu được từ pic mẫu thử với phổ của chất chuẩn tinh khiết. Chỉ số tương đồng phổ giúp khẳng định chắc chắn pic sắc ký không bị lẫn tạp chất đồng lưu. DAD cũng hỗ trợ theo dõi nền mẫu ở các bước sóng phụ để phát hiện hiện tượng trôi đường nền. Mặc dù độ nhạy của DAD thấp hơn FLD khoảng mười đến một trăm lần, tính năng định danh của DAD là vô cùng quan trọng. Phương pháp kết hợp DAD đảm bảo kết quả phân tích đạt độ tin cậy tuyệt đối theo tiêu chuẩn quốc tế.

Nghiên cứu phát triển phương pháp huỳnh quang nhạy cảm quang hóa sử dụng ion đất hiếm Europium (III). Moxifloxacin tạo phức chelate bền vững với ion Eu3+ trong môi trường đệm kiềm nhẹ hoặc trung tính. Khi có mặt chất trợ huỳnh quang natri dodecylbenzen sulfonat (SBDS), cường độ phát xạ huỳnh quang tăng vọt gấp hàng chục lần. Quá trình truyền năng lượng nội phân tử từ phối tử moxifloxacin sang ion trung tâm Eu3+ diễn ra rất hiệu quả. Phức chất Eu(III)-MOXI-SBDS phát xạ ánh sáng huỳnh quang đặc trưng với đỉnh cực đại sắc nét. Phương pháp tạo phức huỳnh quang nhạy cảm Europium cho phép hạ thấp giới hạn định lượng xuống mức cực vết. Kỹ thuật này mở ra hướng tiếp cận mới trong phân tích siêu vết moxifloxacin mà không cần chiết tách phức tạp.