Luận án tiến sĩ: Tổng hợp và đánh giá hoạt tính kháng ung thư tubulysin

1 MỞ ĐẦU Các hợp chất thiên nhiên đƣợc xem là nguồn cung cấp vô hạn các lớp chất có hoạt tính sinh học lý thú phục vụ cho nghiên cứu và ứng dụng trong y học. Sự phong phú và đa dạng về các lớp khung chất có hoạt tính sinh học cao, đặc biệt là cơ chế tác dụng của mỗi lớp khung chất này, đã thu hút đƣợc sự quan tâm của các nhà nghiên cứu từ trƣớc đến nay. Cho đến nay, việc nghiên cứu các hoạt chất từ các nguồn vi sinh vật đã và đang thu đƣợc các kết quả tốt trong việc phát triển thuốc. Các nghiên cứu từ vi khuẩn cho thấy, niêm khuẩn cung cấp số lƣợng đáng kể các hoạt chất có hoạt tính sinh học (chiếm khoảng 5%) [1-4].

Với lƣợng lớn các chất thể hiện hoạt tính kháng tế bào ung thƣ mạnh, trong đó một số hoạt chất đã đƣợc phát triển thành thuốc ứng dụng trong điều trị bệnh ung thƣ nhƣ epothilone và một số dẫn xuất [5,6]. Tuy nhiên, một trong các hạn chế từ lớp niêm khuẩn là các hoạt chất đều chứa hàm lƣợng rất nhỏ, không đáp ứng đƣợc nhu cầu của việc nghiên cứu chuyên sâu. Do đó để phục vụ cho mục đích nghiên cứu phát triển thuốc, các hợp chất từ các nguồn vi sinh vật này thƣờng đạt đƣợc bằng cách tổng hợp toàn phần hoặc sẽ đƣợc biến đổi về cấu trúc hóa học nhằm tạo ra lƣợng lớn sản phẩm cũng nhƣ các dẫn xuất mới. Hiện nay, có rất nhiều nghiên cứu tập trung vào sàng lọc, phát triển các lớp chất có hoạt tính gây độc tế bào cao, nhằm phát triển các thuốc kháng ung thƣ.

Cho đến nay các hoạt chất can thiệp vào chu trình của tế bào, quá trình hình thành hoặc phân rã của vi ống, đã cho hiệu quả cao trong hóa trị liệu ung thƣ. Điều này do vai trò đặc biệt quan trọng của vi ống cho sự sống của tế bào ung thƣ, giữ vai trò thiết yếu cho sự phát triển và phân bào, duy trì hình thái học và có thể gây cảm ứng dẫn đến chết tế bào theo chƣơng trình (apoptosis) [7,8]. Do vậy, các nghiên cứu phát triển thuốc dựa trên đích là vi ống hứa hẹn nhiều triển vọng với hiệu quả tốt. Tubulysin là một lớp chất tetrapeptide, đƣợc phân lập lần đầu tiên năm 2000 từ 2 dòng niêm khuẩn là Angiococcus disciformis An d48 và Archangium gephyra Ar 315 [9].

Các nghiên cứu đã cho thấy tubulysin là lớp chất kháng phân bào tốt nhất đƣợc biết đến cho tới nay. Hoạt tính ức chế tế bào ung thƣ của các tubulysin thể hiện trong phạm vi rộng trên nhiều dòng tế bào ung thƣ ngƣời nhƣ: ung thƣ buồng trứng, ung thƣ vú, ung thƣ tuyến tiền liệt, ruột kết, phổi và ung thƣ máu [10,11]. 2 Nghiên cứu trong ống nghiệm (in vitro) và cơ thể sống (in vivo) cho thấy các tubulysin có độc tính với tế bào ung thƣ cao, giá trị IC50 trên một số dòng tế bào ung thƣ từ vài chục picomol đến vài nanomol. Tubulysin ức chế sự phát triển tế bào u vƣợt trội khoảng 20-1000 lần so với các thuốc chống ung thƣ đang sử dụng nhƣ vinblastine, epothilone hay taxol [10,12].

Các tubulysin thể hiện hoạt tính gây độc tế bào qua cơ chế ức chế trùng hợp vi ống, dẫn đến bắt giữ phân bào (G2/M) và gây chết tế bào theo chƣơng trình [10,13]. Theo đánh giá của các nhà hóa dƣợc, tubulysin thiên nhiên là hợp chất hàng đầu cho nghiên cứu và phát triển thuốc chống ung thƣ mới. Tuy nhiên, hàm lƣợng của chúng trong niêm khuẩn rất thấp, do đó hƣớng nghiên cứu tổng hợp toàn phần các tubulysin và các dẫn xuất của chúng là rất cần thiết và có ý nghĩa khoa học. Đề tài “Tổng hợp và đánh giá hoạt tính kháng ung thư của các dẫn xuất tubulysin” tiến hành nghiên cứu tổng hợp toàn phần các dẫn xuất và chất tƣơng tự tubulysin mới dựa trên biến đổi hóa học của các amino acid ở đầu N- và C-terminal, thay thế nhóm N,O- acetyl bằng nhóm methyl.

Nhằm góp phần làm sáng tỏ tƣơng quan giữa hoạt tính và cấu trúc hóa học của lớp chất tubulysin, đồng thời tìm kiếm những hợp chất mới có hoạt tính sinh học đáng chú ý. NIÊM KHUẨN, CÁC HOẠT CHẤT VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC 1. Niêm khuẩn Niêm khuẩn (vi khuẩn nhớt) là nhóm vi khuẩn gram âm thuộc bộ δ-proteobacteria, sống chủ yếu trong đất, xác thực vật, phân động vật và trong môi trƣờng biển. Hầu hết các loài niêm khuẩn có các biểu hiện khác biệt về hình dạng so với các vi khuẩn khác là khả năng tập hợp lại với nhau để tạo thành kiểu hình thể dạng quả đa bào phức tạp trong điều kiện thiếu thức ăn (Hình 1.

Đặc tính sinh học nổi bật của niêm khuẩn là khả năng tạo ra các lớp chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học lý thú. Đến nay, đã có hơn 500 hợp chất, dựa trên 100 cấu trúc khung cơ sở khác nhau đã đƣợc phân lập và xác định cấu trúc hóa học. Các hợp chất này đều thể hiện các hoạt tính sinh học đa dạng nhƣ: hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, gây độc tế bào, kháng vi-rút, ức chế miễn dịch và chống oxy hóa. Trong đó hoạt tính gây độc tế bào đối với các dòng tế bào ung thƣ thể hiện nổi trội nhất, hứa hẹn nhiều tiềm năng trong nghiên cứu và phát triển thuốc [3,5,14,15].1: Một số hình thể dạng quả đa bào của niêm khuẩn [2,3].

Một số hoạt chất và hoạt tính sinh học từ niêm khuẩn Niêm khuẩn đƣợc xem là nguồn sản xuất các lớp chất thứ cấp đa dạng về cấu trúc với những hoạt tính sinh học lý thú. Các lớp chất từ niêm khuẩn đã góp phần quan trọng trong phát triển các thuốc mới điều trị các bệnh truyền nhiễm và đặc biệt là các bệnh liên quan đến khối u [16,17]. Trong đó, nhóm các hợp chất có hoạt tính 4 mạnh đã đƣợc quan tâm nghiên cứu và cho một số kết quả tốt, nhƣ tubulysin (1), epothilone (2), disorazol (3). Một dẫn xuất bán tổng hợp từ epothilone là ixabepilone đã đƣợc Cục quản lý thực phẩm và dƣợc phẩm Hoa Kỳ (FDA) phê chuẩn cho phép sử dụng là thuốc điều trị ung thƣ vú di căn kháng taxane vào năm 2007 [6].

Bên cạnh đó, một lƣợng lớn các lớp chất đã và đang đƣợc nghiên cứu để phát triển thành các thuốc chống ung thƣ mới. Lớp chất macrolide: Nhiều macrolide có hoạt tính gây độc tế bào mạnh đƣợc phân lập từ niêm khuẩn. Đƣợc phân lập năm 1993 bởi Höfle và cộng sự từ chi Sorangium cellitlosum SMP44 [18,19], epothilone có cấu trúc khung macrolide. Hợp chất macrolactone này có chứa vòng thiazole ở mạch nhánh thể hiện hoạt tính kháng nấm và khả năng gây độc tế bào mạnh.

Năm 1995, Bollag và cộng sự chứng minh cơ chế hoạt động của epothilone tƣơng tự nhƣ taxol, đó là thúc đẩy trùng hợp và làm bền hóa vi ống dẫn đến cảm ứng gây chết tế bào theo chƣơng trình. Epothilone đã đƣợc nghiên cứu thử nghiệm in vivo từ năm 2003 và nếu vƣợt qua các đánh giá của thử nghiệm lâm sàng dẫn chất này sẽ thay thế taxol trong điều trị các khối u đa kháng thuốc [5].2), đƣợc phân lập từ chi Sorangium cellulosum Soce12 bởi Jansen và cộng sự năm 1993 [20,21]. Lớp chất disorazole là những macrodilactone của hai hợp chất 2-pentadecyloxazol-4-carboxylic acid, với một số sự thay đổi vị trí và cấu hình của các liên kết đôi và các nhóm thế oxi nhƣ epoxi, hydroxyl hoặc methyl ether trong mạch carbon. Các hợp chất macrodilactone thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh trên các dòng tế bào ung thƣ ngƣời.

Disorazol A1 gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thƣ biểu mô phổi, với giá trị IC50 = 2 pM và trên dòng tế bào nguyên bào sợi (L-929) của chuột với IC50 = 3 pM [20-22]. Trong một kết quả nghiên cứu khác, disorazol C1 thể hiện hoạt tính chống tăng sinh với nhiều tế bào khối u, gây ra sự lão hóa tế bào sớm và cảm ứng dẫn đến quá trình chết tế bào theo chƣơng trình (apoptosis) [23].2) đƣợc phân lập bởi Sasse và cộng sự năm 2003 từ việc nuôi cấy các niêm khuẩn chủng Archangium gephyra và Cystobacter sp. Các hợp chất này cũng bao gồm một vòng macrolactone có chứa vòng thiazole ở mạch nhánh. Nghiên cứu về tác dụng sinh học cho thấy các chất thể hiện hoạt tính 5 mạnh trên nhiều dòng tế bào ung thƣ của động vật có vú, với các giá trị IC50 trên các dòng tế bào khác nhau từ 0,1 đến 1 ng/ml [24].

Một số cấu trúc macrolide từ niêm khuẩn Chivosazol (5) (Hình 1.2) đƣợc phân lập bởi Irschik và cộng sự năm 1995 từ chi Sorangium cellulosumstrain Soeel2. Chất 5 có cấu trúc vòng lớn với một vòng oxazol và liên kết glycoside với 6-deoxyglucose tại C-11. Chivosazol cho thấy hoạt tính với các loại nấm men và nấm sợi, và biểu hiện hoạt tính mạnh với các dòng tế bào của động vật có vú [25]. Lớp chất peptide: Tiêu biểu cho lớp chất peptide phân lập từ niêm khuẩn có thể kể đến nhƣ tubulysin (1), chondramide (6), bengamide (7), nannocystin (8) Tubulysin (1).3), là tetrapeptide đƣợc phân lập năm 2000 từ 2 dòng niêm khuẩn Archangium gephyra và Cystobacter sp.

Lớp chất tubulysin đƣợc đánh giá có hoạt tính với một số dòng tế bào ung thƣ mạnh hơn từ 20 đến 100 lần vinblastine và taxol [10,13]. Tubulysin D thể hiện tác dụng độc tính đối với dòng tế bào ung thƣ bạch cầu ngƣời (HL-60), và dòng tế bào U-lympho mô bào ngƣời (U- 937) ở giá trị IC50 = 3 pM. Các tubulysin đang đƣợc nghiên cứu tiền lâm sàng và nghiên cứu thử nghiệm kết hợp với các kháng thể đơn dòng bằng cách tạo các liên hợp thuốc- kháng thể (antibody-drug conjugates) nhằm giảm độc tính đối với các tế bào thƣờng, trong khi 6 vẫn duy trì đƣợc hoạt tính mạnh đối với các dòng tế bào ƣng thƣ (Hình 1. Sự phát triển tiền lâm sàng của tubulysin là chất chống ung thƣ mới hứa hẹn thu đƣợc nhiều kết quả đáng chú ý [10,26,27].

Một số cấu trúc liên hợp thuốc- kháng thể (ADCs) của tubulysin [27] Cấu trúc depsipeptide trong chondramide (6) (Hình 1.4) đƣợc phân lập từ loài Chondromyces crocatus bởi Jansen và cộng sự năm 1995 [28], thể hiện hoạt tính kháng nấm và gây độc tế bào ở nồng độ vài nanomol. Cấu trúc vòng lớn của chondramide chứa ba amino acid và một polyketide: alanine, N-methyltryptophan, α-methoxy-β-tyrosine và 7-hydroxytrimethyloctenoic acid.4), đƣợc phân lập từ loài Myxococcus virescens và loài bọt biển Jaspis coriacea [29,30]. Bengamide chứa các yếu tố cấu trúc bất thƣờng, bao gồm các hợp chất sinh tổng hợp ketide và amino acid cùng nhau tạo ra các chất kháng khuẩn và gây độc tế bào thú vị.