Luận án nghiên cứu squalene từ vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 - Định hướng ứng dụng trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm

Tính cấp thiết của luận án Việt Nam có trên 3.200 km bờ biển với một nguồn sinh vật biển nhiệt Ďới rất Ďa dạng, phong phú về thành phần loài và giàu các hợp chất tự nhiên có thể ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, y dược. Trong Ďó vi tảo với ưu Ďiểm chính là giàu dinh dưỡng, có kích thước tế bào nhỏ (< 10 µm) phù hợp với miệng của các ấu trùng thủy hải sản, dễ tiêu hóa, không Ďộc, có tốc Ďộ sinh trưởng cao và sức chống chịu cao với những Ďiều kiện khắc nghiệt của môi trường, Ďược coi là mắt xích Ďầu tiên, nguồn sinh khối sơ cấp quan trọng trong chuỗi thức ăn biển. Ngoài ra, sinh khối vi tảo cũng chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học quan trọng cho người và Ďộng vật nuôi như: các loại sắc tố, vitamin, khoáng chất, protein, các acid béo không bão hòa Ďa nối Ďôi (polyunsaturated fatty acid - PUFA).Ďặc biệt là squalene. Squalene là một tripterpene tự nhiên, là tiền chất steroid của Ďộng, thực vật thường Ďược sử dụng trong các sản phẩm dinh dưỡng, chăm sóc sức khỏe, mỹ phẩm và y học.

Squalene Ďược ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp mỹ phẩm, có tác dụng chống khô da và làm mềm da, có vai trò bảo vệ da khỏi các tác hại do ánh sáng, tia UV gây ra. Các nghiên cứu dịch tễ học Ďã cho thấy squalene ức chế hiệu quả các tác nhân hóa học có khả năng gây ung thư ruột kết, phổi, da ở Ďộng vật thực nghiệm. Squalene cần thiết cho cơ thể do nó là một chất chống oxy hoá tự nhiên có vai trò bảo vệ các tế bào khỏi các gốc tự do và oxy phân tử có hoạt tính cao, có khả năng tăng cường hoạt Ďộng của hệ miễn dịch. Việc cung cấp thực phẩm chức năng có thành phần squalene cao (khoảng 500 mg/ngày) Ďã Ďược chứng minh là cần thiết cho sức khỏe dinh dưỡng của con người, làm giảm Ďáng kể bệnh tim mạch và ung thư vì vậy, chúng cũng Ďược dùng phổ biến trong dược phẩm.

Cho Ďến nay, các nguồn sản xuất squalene Ďược biết Ďến nhiều nhất là các loại dầu Ďộng, thực vật. Tuy nhiên, việc khai thác quá mức làm ảnh hưởng Ďến sự bảo tồn nguồn lợi cá biển trong tự nhiên, cũng như sự phụ thuộc vào thổ nhưỡng, mùa vụ của các loại cây trồng có dầu dẫn Ďến nguồn khai thác squalene Ďang dần cạn kiệt. Trong khi Ďó, hiện nay trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng, nhu cầu về squalene làm nguyên liệu trong ngành công nghiệp dược phẩm và mỹ phẩm Ďang ngày càng tăng. Do vậy, việc tìm kiếm và phát triển các nguồn nguyên liệu mới thay thế nguồn truyền thống Ďể tách chiết squalene là rất cần thiết và Ďang Ďược các nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm nghiên cứu.

Trong Ďó, vi sinh vật nói chung và vi tảo biển nói riêng là một nguồn tiềm năng cho sản xuất squalene trên quy mô 2 lớn. Gần Ďây một số các loài vi tảo biển dị dưỡng (VTBDD) như thraustochytrids Ďược xem như là các nhà máy tế bào tiềm năng cho sản xuất các chất có giá trị cao trong Ďó có squalene. Tuy nhiên việc nghiên cứu squalene ở Việt Nam mới Ďược bắt Ďầu từ 2012, kết quả nghiên cứu mới chỉ dừng ở việc cung cấp cơ sở khoa học ban Ďầu về hàm lượng squalene từ một số chủng vi tảo, chưa có Ďược các phương pháp tối ưu cho tách chiết, làm giàu và tinh sạch squalene; chưa có Ďược Ďiều kiện nuôi trồng tối ưu vi tảo tiềm năng có sức sản xuất sinh khối có hàm lượng squalene cao; chưa có Ďược quy trình công nghệ tạo chế phẩm squalene có hoạt tính sinh học bảo Ďảm an toàn cho sử dụng theo Ďịnh hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm ở Việt Nam. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện Ďề tài “Nghiên cứu squalene từ vi tảo biển dị dƣỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 định hƣớng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dƣợc phẩm”.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án - Sàng lọc và xác Ďịnh Ďược Ďiều kiện nuôi trồng thích hợp của chủng Schizochytrium mangrovei PQ6 của Việt Nam, tiềm năng lựa chọn Ďược cho sản xuất squalene. - Xác Ďịnh Ďiều kiện thích hợp cho tách chiết, làm sạch squalene từ sinh khối chủng S. mangrovei PQ6 lựa chọn Ďược; Ďánh giá Ďộ an toàn và tác dụng sinh học, dược lý của squalene tách chiết Ďược theo Ďịnh hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án - Sàng lọc Ďược chủng/loài vi tảo biển của Việt Nam tiềm năng cho sản xuất squalene từ một số chủng vi tảo biển Việt Nam - Tối ưu Ďiều kiện nuôi cấy Ďể thu Ďược sinh khối tảo có hàm lượng squalene cao ở chủng tiềm năng lựa chọn Ďược ở quy mô bình tam giác; bình lên men 30 Lít.

- Tối ưu Ďiều kiện tách chiết, làm giàu và tinh sạch squalene từ sinh khối chủng vi tảo biển lựa chọn Ďược; xây dựng quy trình tách chiết và tinh sạch squalene; xác Ďịnh Ďộ sạch và cấu trúc của squalene tách chiết Ďược. - Đánh giá tính an toàn của squalene bao gồm Ďộc tính cấp và bán trường diễn, tác dụng sinh dược trên mô hình in vivo (mô hình Ďộng vật thực nghiệm). - Bước Ďầu nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm cholesterol của squalene trên mô hình in vitro (mô hình tế bào). Những đóng góp mới của luận án - Luận án là công trình Ďầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách bài bản, có hệ thống về: sàng lọc; nuôi trồng chủng tiềm năng Schizochytrium mangrovei PQ6 3 có hàm lượng squalene cao (sản lượng squalene Ďạt Ďược sau quá trình lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất là 6,9 g/L); lựa chọn Ďược Ďiều kiện thích hợp cho tách chiết, làm sạch squalene từ chủng PQ6 có Ďộ tinh sạch Ďạt 90- 95%; squalene tách chiết Ďược là an toàn, có tác dụng làm giảm cholesterol tổng số và làm tăng hàm lượng lipoptrotein có tỷ trọng cao gắn với cholesterol ở mô hình Ďộng vật thực nghiệm, Ďịnh hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm.

- Lần Ďầu tiên ở Việt Nam Ďã chứng minh Ďược squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 có tác dụng giảm cholesterol do tăng Ďiều hòa biểu hiện của các gen tham gia vào quá trình hấp thu, vận chuyển, lưu thông cholesterol từ các mô ngoại biên Ďến tế bào gan; bước Ďầu nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm triglyceride của squalene. Ý nghĩa khoa học thực tiễn của luận án - Có Ďược những dẫn liệu khoa học về Ďiều kiện nuôi trồng thích hợp của chủng S. mangrovei PQ6 phân lập Ďược từ huyện Ďảo Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang vào năm 2006-2008 (lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất glucose 22% vào môi trường nuôi tại 36 h; bổ sung 0,4% hỗn hợp vitamin (vitamin B1- 45g/L; vitamin B6 - 45 g/L; và vitamin B12- 0,25g/L)) cho sinh trưởng Ďạt sinh khối khô (75,41±1,35) g/L, hàm lượng squalene Ďạt (91,53±2,45) mg/g sinh khối khô, sản lượng squalene Ďạt 6,9 g/L.

- Có Ďược quy trình tách chiết lượng lớn squalene từ chủng S. mangrovei PQ6 có Ďộ tinh sạch cao 90- 95%, an toàn và Ďạt tiêu chuẩn Ďảm bảo chất lượng Ďịnh hướng làm nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm chức năng, mỹ phẩm và dược phẩm. - Góp phần làm sáng tỏ squalene tách chiết từ chủng PQ6 có tác dụng giảm cholesterol và tryglycerol nội bào, tăng hàm lượng cholesterol gắn với lipoprotein có tỷ trọng cao, HDL-C và tỷ lệ HDL-C/cholesterol toàn phần trong máu; giảm cholesterol gắn với LDL-C và VLDL-C trong máu mà không gây ảnh hưởng Ďến sự phát triển cân nặng cơ thể và gan, cholesterol toàn phần và tryglyceride ở mô hình tế bào và Ďộng vật thực nghiệm; bước Ďầu Ďã cung cấp cơ sở khoa học cho việc Ďịnh hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm có. Bố cục của luận án Luận án gồm 148 trang, trong Ďó phần mở Ďầu 3 trang; Tổng quan tài liệu 39 trang; Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 22 trang; Kết quả và thảo luận 62 trang; Kết luận và kiến nghị 2 trang; Danh mục các công trình Ďã công bố 2 trang; Tài liệu tham khảo 18 trang gồm 179 tài liệu.

Trong luận án có 19 bảng, 45 hình và 28 trang phụ lục. 4 CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu chung về squalene 1. Tính chất hóa lý của squalene Squalene có cấu tạo (2,6,10,15,19,23-hexanmethyltetracosa-2,6,10,14,18,22- hexane) - là một chất trao Ďổi trung gian quan trọng trong sinh tổng hợp sterol và triterpenes ở Ďộng vật và thực vật.

Squalene là một chất lỏng dạng dầu, trong suốt với trọng lượng phân tử là 410,7 g/mol, tỷ trọng 0,858 g /mL, nhiệt Ďộ nóng chảy 20°C, hợp chất này có thể hòa tan trong dung môi hữu cơ nhưng không hòa tan trong nước [1, 2].1 Ďưa ra một số tính chất của squalene như Ďộ nhớt, tỷ trọng, Ďộ hòa tan và những thông số này khẳng Ďịnh bản chất kị nước mạnh mẽ của phân tử này. Các thông số lý hóa của squalene [3] Tính chất Giá trị Trọng lượng phân tử 410,7 g/mol Điểm nóng chảy -75oC Chi số khúc xạ 1,499 Độ nhớt ở 25oC 12 cP Tỷ trọng 0,858 g/mL Điểm sôi ở 25oC 285oC Điểm chớp cháy 110oC Chỉ số Iod 381 g/100g Các Ďỉnh hồng ngoại 2728, 1668, 1446, 1380, 1150, 1180, 964, 835 cm-1 Sức căng bề mặt ~ 32 mN/m Khả năng hòa tan của squalene trong nước 0,124 mg/L 1. Nguồn gốc và cấu trúc của squalene Squalene Ďược phát hiện vào năm 1096 bởi nhà nghiên cứu người Nhật, TS. Mitsumaru Tsujimoto, một chuyên gia về dầu và chất béo tại trạm kiểm Ďịnh Công nghiệp Tokyo.

Ông Ďã phân tách phần không xà phòng hóa từ dầu gan cá mập “kuroko - zame” và khám phá ra sự tồn tại một lượng lớn hydrocacbon không bão hòa. Tại thời Ďiểm Ďó, TS. Mitsumaru Tsujimoto không phân tách Ďược hợp chất này. Tuy nhiên, ông Ďã thu Ďược thành phần bromine dưới dạng bột màu trắng, phân hủy ở 155oC, trong Ďó chứa 26,93% C, 3,94% H và 69,28% Br.

Ông Ďưa ra 5 công thức cho hợp chất này là C10H18Br4. Mười năm sau, TS. Ďã thành công trong việc chưng cất chân không một phân Ďoạn của dầu từ gan của hai con cá mập biển sâu, một hydrocacbon không bão hòa với công thức C30H50, Ông gọi nó là “squalene”, từ gốc Latin là “Squalus” (cá mập) [4, 5]. Năm 1934, Robinson Ďã công bố cấu trúc vòng của squalene với phân tử steroit.

Năm 1936, cấu trúc sinh học của squalene Ďược mô tả lần Ďầu tiên bởi nhà nghiên cứu Paul Karrer - người cũng Ďã khám phá ra cấu trúc hóa học của vitamin A và E [6].