Luận án tiến sĩ dược học: Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của ba loài Gynostemma Blume ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM TUẤN ANH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA BA LOÀI THUỘC CHI GYNOSTEMMA BLUME Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM TUẤN ANH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA BA LOÀI THUỘC CHI GYNOSTEMMA BLUME Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LIỆU - DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 62731001 Người hướng dẫn khoa học: GS. Phạm Thanh Kỳ HÀ NỘI, NĂM 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của GS. Phạm Thanh Kỳ. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác.

Tác giả Phạm Tuấn Anh LỜI CẢM ƠN Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành bản luận án này tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của Trường Đại học Dược Hà Nội, các Thầy cô giáo, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực cùng đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS. Phạm Thanh Kỳ - người Thầy đã trực tiếp hướng dẫn, hết lòng chỉ bảo tận tình và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học. Tôi xin chân thành cảm ơn: Thầy cô giáo và các cán bộ đồng nghiệp Bộ môn Dược liệu, trường Đại học Dược Hà Nội.

Các thầy cô giáo, các cán bộ và nhóm nghiên cứu tại Bộ môn Thực vật, Bộ môn Dược học cổ truyền, trường Đại học Dược Hà Nội. Các cán bộ Phòng Đào tạo sau đại học, trường Đại học Dược Hà Nội. Các cán bộ Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Các cán bộ tại Bộ môn Dược lý – Đại học Y Hà Nội, Bộ môn Dược lý – Học viện Quân Y. Đã giúp đỡ về chuyên môn và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi khi thực hiện luận án này.

Nhân dịp này tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Đảng ủy, Ban Giám hiệu, các cán bộ phòng ban, các bộ môn chuyên ngành trong trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận án. Tôi cũng rất biết ơn tới những đồng nghiệp, bạn bè và người thân trong gia đình là bố mẹ, vợ, các anh chị em và các con đã luôn kịp thời động viên và hỗ trợ về tinh thần cho tôi. Xin trân trọng cảm ơn. Phạm Tuấn Anh MỤC LỤC Nội dung Trang ĐẶT VẤN ĐỀ.

Vị trí phân loại, phân bố và đặc điểm thực vật của chi Gynostemma Blume 3 1. Vị trí phân loại của chi Gynostemma Blume. Phân bố của chi Gynostemma Blume. Đặc điểm thực vật chi Gynostemma Blume.

Thành phần hóa học của chi Gynostemma Blume. Nhóm saponin trong chi Gynostemma Blume. Các flavonoid phân lập từ chi Gynostemma Blume. Các nhóm chất khác.

Tác dụng sinh học và độc tính của chi Gynostemma Blume. Tác dụng chống ung thư. Tác dụng điều hòa miễn dịch. Tác dụng trên chuyển hóa lipid.

Tác dụng hạ đường huyết. Tác dụng trên tim mạch. Tác dụng trên hệ thần kinh trung ương. Tác dụng ức chế kết tập tiểu cầu và chuyển hóa acid arachidonic.

Tác dụng bảo vệ gan, giải độc và chống oxy hóa. Một số nghiên cứu về chi Gynostemma Blume ở Việt Nam. Nghiên cứu về thực vật. Nghiên cứu về thành phần hóa học.

Nghiên cứu về độc tính và tác dụng sinh học. Nghiên cứu về trồng GCL. Công dụng và sử dụng của các loài trong chi Gynostemma Blume. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

Nguyên liệu, trang thiết bị nghiên cứu. Mẫu nghiên cứu. Hóa chất, dung môi. Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu.

Nội dung và phương pháp nghiên cứu. Giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu. Nghiên cứu thành phần hóa học. Đánh giá độc tính cấp.

Nghiên cứu tác dụng gây độc tế bào. Nghiên cứu tác dụng ức chế NF-κB và chống viêm. Xử lý số liệu. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.

Kết quả thẩm định tên khoa học của mẫu nghiên cứu. Gynostemma pentaphyllum (Thunb. Wu – GCL cuống quả dài. Gynostemma laxum (Wall.

– thư tràng thưa, Cổ yếm lá bóng69 3. Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của ba loài GCL. Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học. Nhận dạng các hợp chất hữu cơ đã phân lập được.

Kết quả nghiên cứu độc tính cấp. Đánh giá độc tính cấp của G. Đánh giá độc tính cấp của G. Kết quả nghiên cứu độc tính tế bào trên một số dòng tế bào ung thư.

Khảo sát độc tính tế bào của các phân đoạn. Đánh giá độc tính tế bào của các chất phân lập được. Kết quả nghiên cứu tác dụng ức chế NF-κB và chống viêm. Tác dụng ức chế NF-κB.

Tác dụng chống viêm. Về phân loại các loài trong chi Gynostemma Blume. Về thành phần hóa học. Về kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ.

Về kết quả phân lập các hợp chất. Về độc tính cấp và tác dụng sinh học. Về độc tính cấp. Về tác dụng gây độc tế bào của phân đoạn chiết và các saponin tinh khiết.

Về tác dụng ức chế NF-κB và chống viêm. 143 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 145 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ. 147 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO.

PL00 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Viết đầy đủ Ara α-L-arabinopyranosyl DMSO Dimethyl sulfoxid High performance liquid chromatography HPLC – Sắc ký lỏng hiệu năng cao HSCs Hepatic Stellate Cells IgM Immunoglobulin M MDA Malondialdehyde MS Mass spectroscopy – Phổ khối 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl MTT (59) tetrazolium bromid Nulear magnetic resonance – Phổ cộng NMR hưởng từ hạt nhân IR Infra red – phổ hồng ngoại G. Gynostemma GCL Giảo cổ lam Glc β-D-glucopyranosyl G. Gynostemma yixingense PAR Paracetamol Rha α-L-rhamnopyranosyl RP Reversed phase – pha đảo STZ Streptozotocin UV Ultra violet – phổ tử ngoại TKTW Thần kinh trung ương Ttc Thể trọng chuột Xyl β-D-xylopyranosyl DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1. Danh sách các loài thuộc chi Gynostemma Blume [145].

Các gypenosid 3β,19,20β-trihydroxydammar-24-en. Các dẫn chất 3β,20β-dihydroxydammar-24-en-19-al. Các dẫn chất 2α,3β,20β-trihydroxydammar-24-en. Các dẫn chất protopanaxadiol.

Các dẫn chất 3β,12β,19,20β-tetrahydroxydammar-24-en. Các dẫn chất 20R của 3β,12β,19,20β-tetrahydroxydammar-24-en. Các hợp chất có cấu trúc 2α,3β,12β,20β-tetrahydroxydammar-24-en19 Bảng 1. Các dẫn chất có cấu trúc 3β,20β-dihydroxydammar-24-en-12-on.

Các hợp chất 3β,20β,21-trihydroxydammar-24-en. Các hợp chất có cấu trúc 3,20-dihydroxydammar-24-en-21-oic. Các gypenosid khung 3β,12β,20β,26-tetrahydroxydammar-24-en. Hợp chất có cấu trúc 20β-hydroxydammar-24-en 12,23-dion.

Các hợp chất 3β,12β,20β-trihydroxydammar-23-en. Các dẫn chất có cấu trúc 3β,20β-dihydroxydammar-23-en-12-on. Hợp chất có cấu trúc 3β,21,26-trihydroxydammar-23-en. Các gypenosid 3β,12β,20β,21-tetrahydroxydammar-23-en.

Các hợp chất 3β,20β-dihydroxydammar-23-en-21,29-dioic. Các hợp chất 3β,12β,20β-trihydroxydammar-25-en. Hợp chất có cấu trúc 3β,20β,21-trihydroxydammar-25-en. Hợp chất 3β,20β-dihydroxydammar-25-en-21,29-dioic.

Các hợp chất 3β,20β,21-trihydroxydammar-23,25-dien. Các hợp chất 3β,12β-dihydroxydammar-20,24-dien. Các hợp chất 3β,20β,21-trihydroxydammaran. Các hợp chất 3β-hydroxydammar-24-en-21,23-lacton.

Các hợp chất 3β-hydroxy-20,25-epoxydammaran. Các hợp chất 3β,25-dihydroxy-20,24-epoxydammaran. Các hợp chất 3β-hydroxy-21,24-cyclodammaran. Hợp chất 3β-hydroxy-20,24;20,12-diepoxydammaran.

Hợp chất có cấu trúc 3β-hydroxy-hexanordammaran-20-on. Các flavonoid phân lập được từ chi Gynostemma. Tác dụng chống ung thư thực nghiệm của G. Kết quả định tính các nhóm chất chính trong Gynostemma longipes 71 Bảng 3.

Kết quả định tính các nhóm chất chính trong Gynostemma laxum. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất SAP2. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất SAP8. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất SAP4.

Dữ liệu phổ NMR của hợp chất SAP7. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất SAP1. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất SAP5. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất SAP3.

Dữ liệu phổ NMR của hợp chất SAP6. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất CGP1. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất CGP5. Dữ liệu NMR của hợp chất CGP7.

Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GL-2. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GL-10. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GL-7B. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GL-6.

Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GL-9. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất E5. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất E1. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GL-8.

Dữ liệu phổ NMR của GL-1. Kết quả đánh giá độc tính cấp của cao đặc G. Kết quả đánh giá độc tính cấp của cao đặc G. Tỉ lệ % ức chế các dòng tế bào ung thư của các mẫu thử.

IC50 của các mẫu nghiên cứu trên ba dòng tế bào ung thư. IC50 của các hợp chất gypenosid VN1-7 trên một số dòng tế bào ung thư. IC50 của gylongiposid II, III và CGP7 trên một số dòng tế bào ung thư. Bảng so sánh hệ thống phân loại chi Gynostemma Blume.

So sánh nhóm saponin, flavonoid trong ba loài nghiên cứu. Các hợp chất có cấu trúc 3β,20β,21-trihydroxydammar-24-en. 136 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1. Hình vẽ loài G.

Hình vẽ loài G. Hình vẽ loài G. Khung cấu trúc dammaran. Cấu trúc chung của các gypenosid.

Khung cấu trúc 3β,20β-dihydroxydammar-24-en. Khung 3β,12β,20β-trihydroxydammar-24-en. Đồng phân 20R của dẫn chất 3β,12β,19,20β-tetrahydroxydammar-24- en. Khung cấu trúc 3β,20β-dihydroxydammar-24-en-12-on.

Cấu trúc 3β,20β,21-trihydroxydammar-24-en. Cấu trúc 3,20-dihydroxydammar-24-en-21-oic. Cấu trúc 3β,12β,20β,26-tetrahydroxydammar-24-en. Cấu trúc 20β-hydroxydammar-24-en 12,23-dion.

Cấu trúc 3β,12β,20β-trihydroxydammar-23-en. Khung cấu trúc 3β,20β-dihydroxydammar-23-en-12-on. Cấu trúc 3β,20β,26-trihydroxydammar-23-en. Cấu trúc 3β,12β,20β,21-tetrahydroxydammar-23-en.

Cấu trúc 3β,20β-dihydroxydammar-23-en-21,29-dioic. Cấu trúc 3β,12β,20β-trihydroxydammar-25-en. Cấu trúc 3β,20β,21-trihydroxydammar-25-en. Cấu trúc 3β,20β-dihydroxydammar-25-en-21,29-dioic.

Cấu trúc 3β,20β,21-trihydroxydammar-23,25-dien. Cấu trúc 3β,12β-dihydroxydammar-20,24-dien. Cấu trúc 3β,20β,21-trihydroxydammaran. Cấu trúc 3β-hydroxy-21,23-epoxydammar-24-en.

Cấu trúc 3β-hydroxydammar-24-en-21,23-lacton. Cấu trúc 3β-hydroxy-20,25-epoxydammaran. Cấu trúc 3β,25-dihydroxy-20,24-epoxydammaran. Khung cấu trúc chung của các 3β-hydroxy-21,24-cyclodammaran.

Cấu trúc 3β-hydroxy-20,24;20,12-diepoxydammaran. Cấu trúc 3β-hydroxy-hexanordammaran-20-on. Vinagynostesid A phân lập từ Gynostemma longipes C. Sơ đồ chiết xuất cao đặc dược liệu 5:1.

Sơ đồ phân lập các hợp chất từ G. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ G. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ G. Gynostemma pentaphyllum (Thunb.

Wu – GCL cuống quả dài. Gynostemma laxum (Wall. – Cổ yếm lá bóng. Cấu trúc của hợp chất SAP2.

Tương tác HMBC của hợp chất SAP8. Cấu trúc của hợp chất SAP8 (gypenosid VN1). Tương tác HMBC và ROESY của hợp chất SAP4. Cấu trúc của hợp chất SAP4 (gypenosid VN2).

Tương tác HMBC của SAP7. Cấu trúc của hợp chất SAP7 (gypenosid VN3). Tương tác HMBC và 1H-1H COSY của SAP1. Cấu trúc của hợp chất SAP1 (gypenosid VN4).

Tương tác HMBC và ROESY của hợp chất SAP5. Cấu trúc của hợp chất SAP5 (gypenosid VN5) .