Nghiên cứu chiết tách triterpenoid từ Centella asiatica và hoạt tính sinh học - Luận án Tiến sĩ Võ Thị Quỳnh Như

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- VÕ THỊ QUỲNH NHƢ NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, CHUYỂN HÓA HÓA HỌC VÀ THĂM DÕ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC TRITERPENOID TỪ CÂY RAU MÁ [CENTELLA ASIATICA (L.) URBAN] HỌ HOA TÁN (APIACEAE) LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI - 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- VÕ THỊ QUỲNH NHƢ NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, CHUYỂN HÓA HÓA HỌC VÀ THĂM DÕ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC TRITERPENOID TỪ CÂY RAU MÁ [CENTELLA ASIATICA (L.) URBAN] HỌ HOA TÁN (APIACEAE) Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 62 44 01 14 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. Trần Văn Lộc HÀ NỘI - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của GS. Trần Văn Sung và TS. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận án Võ Thị Quỳnh Như LỜI CẢM ƠN Luận án này được hoàn thành tại Phòng Tổng hợp hữu cơ, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trong quá trình nghiên cứu, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ chân tình của các thầy cô, các nhà khoa học cũng như đồng nghiệp, bạn bè và người thân. Với lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, tôi xin gửi đến GS. Trần Văn Sung và TS.

Trần Văn Lộc – những người thầy đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, tận tình hướng dẫn và có nhiều góp ý quý báu trong thời gian thực hiện luận án. Tôi cũng xin cảm ơn đến các cán bộ nghiên cứu phòng Tổng hợp hữu cơ – Viện Hóa học đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực nghiệm và hoàn thành bản luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các nhà khoa học Viện Hóa học đã giảng dạy, hướng dẫn tôi hoàn thành các học phần và các chuyên đề trong chương trình đào tạo. Tôi trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Trường THPT Gio Linh cùng Ban lãnh đạo Viện Hóa học, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian học tập.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến toàn thể gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã ủng hộ và động viên tôi hoàn thành tốt luận án. Luận án được thực hiện với sự tài trợ kinh phí từ đề tài nghiên cứu cơ bản của Quỹ Phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED), mã số 104. Trần Văn Lộc làm chủ nhiệm. Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà nội, ngày tháng năm 2017 Võ Thị Quỳnh Như MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Tổng quan các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học của cây rau má và hoạt tính sinh học của chúng. Đặc điểm thực vật học và ứng dụng của cây rau má trong y học dân gian 2 1. Đặc điểm thực vật.

Phân bố và sinh thái. Tác dụng, công dụng. Các thành phần hóa học của cây rau má. Các hợp chất terpenoid.

Các hợp chất polyphenol. Các lớp chất khác. Một số kết quả nghiên cứu chiết tách triterpene và triterpene glycoside từ cây rau má Centella asiatica (L. Hoạt tính sinh học của cây rau má.

Hoạt tính kháng khuẩn. Hoạt tính giảm đau và kháng viêm. Hoạt tính chống oxy hóa. Tác dụng bảo vệ thần kinh.

Hoạt tính chống xơ vữa động mạch. Hoạt tính sinh học của asiatic acid, madecassic acid và các dẫn xuất. Hoạt tính gây độc tế bào và kháng ung thƣ. Hoạt tính làm lành vết thƣơng.

Hoạt tính chống trầm cảm. Hoạt tính bảo vệ gan. Các hoạt tính khác. Một số chuyển hóa của asiatic acid.

Một số chuyển hóa hóa học của asiatic acid. Chuyển hóa bằng phƣơng pháp sinh học. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

Các phƣơng pháp chiết xuất và phân lập chất. Các phƣơng pháp phổ. Các phƣơng pháp tổng hợp hữu cơ. Phƣơng pháp thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro.

Phƣơng pháp thử hoạt tính bảo vệ gan trên động vật thực nghiệm. Nghiên cứu, dự đoán hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp đƣợc trên hai loại enzyme SIRT1 và 17β-HSD1 (docking phân tử). Mẫu cây rau má. Dung môi, hóa chất.

Phân lập chất. Phân lập các thành phần hóa học của cây rau má thu tại Thành phố Hồ Chí Minh. Phân lập các chất. Các số liệu phổ của các chất phân lập đƣợc.

Nghiên cứu định lƣợng các thành phần triterpene acid chính trong mẫu rau má thu thập ở một số tỉnh thuộc Bắc bộ và Nam bộ. Xác định hàm lƣợng asiatic acid bằng phƣơng pháp HPLC. Xác định hàm lƣợng asiatic acid và madecassic acid bằng sắc ký cột 42 3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của các điều kiện chiết xuất đến hiệu quả thu hồi asiatic acid và madecassic acid.

Ảnh hƣởng của nhiệt độ. Ảnh hƣởng của nồng độ cồn. Ảnh hƣởng của thời gian chiết. Phân lập asiatic acid và madecassic acid từ cây rau má Centella asiatica (L.) Urban làm nguyên liệu để điều chế các dẫn xuất.

Tổng hợp các dẫn xuất của asiatic và madecassic acid. Tổng hợp các dẫn xuất của asiatic acid. Tổng hợp các dẫn xuất của madecassic acid. Thăm dò hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp đƣợc.

Hoạt tính gây độc tế bào in vitro. Hoạt tính bảo vệ gan trên động vật thực nghiệm (in vivo). KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. Phân lập chất.

Nghiên cứu thành phần hóa học của cây rau má thu tại Thành phố Hồ Chí Minh (RMHCM). Định lƣợng asiatic acid và madecassic acid trong một số mẫu rau má bằng phƣơng pháp HPLC. Định lƣợng asiatic acid và madecassic acid trong ba mẫu rau má bằng phƣơng pháp CC. Điều kiện chiết xuất cho hiệu suất cao nhất từ mẫu rau má.

Chuyển hóa hóa học của asiatic acid và madecassic acid. Chuyển hóa của asiatic acid. Chuyển hóa nhóm COOH (C-28). Chuyển hóa vòng A của asiatic acid.

Các dẫn xuất của madecassic acid. Thử hoạt tính sinh học. Hoạt tính gây độc tế bào in vitro. Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các dẫn xuất của asiatic acid.

Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các dẫn xuất của madecassic acid. Hoạt tính bảo vệ gan trên động vật thực nghiệm (in vivo). Nghiên cứu, dự đoán hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp trên mô hình tế bào (docking phân tử) .119 iii Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .122 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN .123 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ .124 TÀI LIỆU THAM KHẢO.125 iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Các phƣơng pháp sắc ký CC Column Chromatography Sắc ký cột thƣờng HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký bản mỏng Các phƣơng pháp phổ 1 H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hƣởng từ hạt Spectroscopy nhân proton 13 C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Phổ cộng hƣởng từ hạt Resonance Spectroscopy nhân carbon 13 GC-MS Gas Chromatography-Mass Sắc ký khí ghép nối khối Spectrometry phổ COSY Correlation Spectroscopy Phổ tƣơng tác hai chiều 1 H-1H DEPT Distortionless Enhancement by Phổ DEPT Polarisation Transfer ESI-MS Electron Spray Ionization Mass Phổ khối ion hóa phun Spectrometry mù điện tử HMBC Heteronuclear Multiple Bond Phổ tƣơng tác dị hạt nhân Correlation qua nhiều liên kết HR-ESI-MS High Resolution - Electron Spray Phổ khối phân giải cao Ionization - Mass Spectrometry ion hóa phun mù điện tử HSQC Heteronuclear Single Quantum Phổ tƣơng tác dị hạt nhân Coherence qua một liên kết IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại J (Hz) Hằng số tƣơng tác tính bằng Hz NOESY Nuclear Overhauser Effect Phổ NOESY Spectroscopy UV Ultraviolet Spectroscopy Phổ tử ngoại δ (ppm) (ppm = part per million) Độ dịch chuyển hóa học tính bằng phần triệu s singlet q quartet dt double triplet d doublet quint quintet br broad t triplet dd double doublet m multiplet v Các dòng tế bào HeLa Human cervical adenocarcinoma Ung thƣ cổ tử cung HepG2 Human hepatocellular Ung thƣ gan carcinoma KB Human epidermoid carcinoma Ung thƣ biểu mô MCF-7 Human breast adenocarcinoma Ung thƣ vú MDA-MB-231 Metastatic human breast cancer Ung thƣ vú Lu Human lung carcinoma Ung thƣ phổi LTB Lymphotoxin-beta SIRT1 Enzyme deacetylase sirtuin-1 17β-HSD1 Enzyme 17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 Các ký hiệu viết tắt khác IC50 Inhibitory Concentration 50% Nồng độ ức chế 50% Mp Melting point Điểm chảy AA Asiatic acid MA Madecassic acid RMST Rau má Sơn Tây RMND Rau má Nam Định RMHCM Rau má Hồ Chí Minh DMAP 4-Dimethylaminopyridine PCC Pyridinium chlorochromate PDC Pyridinium dichromate CTPT Công thức phân tử TEA Triethanolamine DCM Dichloromethane MDA Malon dialdehyde n- n-Butanol Ac Acet BuOH CHCl3 Chloroform Bz Benzoyl DMSO Dimethylsulfoxide OMe Methoxy EtOAc Ethyl acetate Ph Phenyl MeOH Methanol Et Ethyl TBAI tetrabutylammonium iodide Me Methyl TMS Tetramethylsilane THF Tetrahydrofuran AIF apoptosis-inducing factor TPA 12-O- tetradecanoylphorbol- 13-acetate Ghi chú: Tên các hợp chất, lớp chất, nhóm thế, chức hóa học được viết theo nguyên bản Tiếng Anh để đảm bảo tính thống nhất và chính xác.

vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Cây rau má Centella asiatica (L. Các monoterpenoid thu đƣợc từ tinh dầu cây rau má. Các sesquiterpenoid thu đƣợc từ tinh dầu cây rau má.

Các triterpene và triterpene saponin khung ursane đƣợc phân lập từ cây rau má. Các triterpene và triterpene glucoside khung oleanane đƣợc phân lập từ cây rau má. Công thức các hợp chất phenolic phân lập từ cây rau má. Các thành phần hóa học khác đƣợc phân lập từ cây rau má.

Các triterpene và triterpene glycoside đƣợc Yoshida M phân lập từ cây rau má trồng tại Nhật Bản và hoạt tính kháng tế bào ung thƣ của chúng. Các triterpene và triterpene glycoside đƣợc Rumalla phân lập từ cây rau má trồng tại Mỹ. Các triterpene và triterpene glycoside đƣợc Weng phân lập từ cây rau má trồng tai Trung Quốc. Một số sản phẩm thuốc và mỹ phẩm có chứa rau má.

Một số sản phẩm từ cây rau má Việt Nam. Đƣờng chuẩn asiatic acid .112 viii DANH MỤC CÁC BIỂU BẢNG Bảng 3. Giá trị HPLC của asiatic acid. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hiệu quả chiết.

Ảnh hƣởng của nồng độ dung môi chiết đến hiệu quả chiết asiatic acid và madecassic acid. Khảo sát thời gian chiết mẫu rau má khô. Tổng hàm lƣợng asiatic acid và madecassic acid trong ba mẫu rau má xác định theo phƣơng pháp HPLC .