Thiết lập chất đối chiếu Hypophyllanthin, Niranthin và xác định dược động học cao Diệp hạ châu đắng - Phạm Văn Sơn, ĐH Y Dược TP.HCM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH PHẠM VĂN SƠN THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU HYPOPHYLLANTHIN, NIRANTHIN VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THÔNG SỐ DƯỢC ĐỘNG HỌC CỦA CAO CHUẨN HÓA ĐIỀU CHẾ TỪ DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG (PHYLLANTHUS AMARUS SCHUM., EUPHORBIACEAE) LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH PHẠM VĂN SƠN THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU HYPOPHYLLANTHIN, NIRANTHIN VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THÔNG SỐ DƯỢC ĐỘNG HỌC CỦA CAO CHUẨN HÓA ĐIỀU CHẾ TỪ DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG (PHYLLANTHUS AMARUS SCHUM., EUPHORBIACEAE) NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 62720410 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.

NGUYỄN NGỌC VINH TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố ở bất kỳ nơi nào. Tác giả luận án Phạm Văn Sơn i MỤC LỤC MỤC LỤC. i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.

iii DANH MỤC BẢNG. vii DANH MỤC HÌNH, ĐỒ THỊ. xii MỞ ĐẦU. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.

TỔNG QUAN DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VỀ CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP, TINH CHẾ HỢP CHẤT LIGNAN TỪ DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CÁC HỢP CHẤT LIGNAN TRONG DIỆP HẠ CHÂU. TỔNG QUAN VỀ ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG CỦA THUỐC.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.

CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP, TINH CHẾ VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC, ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC. XÁC ĐỊNH CHẤT LƯỢNG VÀ THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU. ĐIỀU CHẾ VÀ TIÊU CHUẨN HÓA CAO DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG. ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ THÔNG SỐ DƯỢC ĐỘNG HỌC CỦA CAO CHUẨN HÓA ĐIỀU CHẾ TỪ DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG.

CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP, TINH CHẾ VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC, ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC. XÁC ĐỊNH CHẤT LƯỢNG VÀ THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU. ĐIỀU CHẾ VÀ TIÊU CHUẨN HÓA CAO DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG. ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ THÔNG SỐ DƯỢC ĐỘNG HỌC CỦA CAO CHUẨN HÓA ĐIỀU CHẾ TỪ DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG.

134 ĐIỂM MỚI CỦA ĐỀ TÀI. 149 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN. 150 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 151 DANH MỤC PHỤ LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Từ nguyên Nghĩa tiếng Việt ACN Acetonitrile As Asymetry Hệ số đối xứng AUC Area under the plasma drug Diện tích dưới đường cong concentration - time curve thời gian - nồng độ thuốc trong huyết tương Cmax Maximum plasma concentration Nồng độ đỉnh trong huyết tương COSY Correlated Spectroscopy Phổ tương quan proton - proton CV Coefficient of Variation Hệ số phân tán d Doublet Đỉnh đôi DAZ Diazepam DCM Dichloromethan dd Doublets of doublet Đỉnh đôi kép DĐVN Dược điển Việt Nam DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DHCĐ Diệp hạ châu đắng DNA Deoxyribonucleic acid DSC Differential Scanning Phân tích nhiệt vi sai Calorimetry EA Ethyl acetate ECD Electrochemical detection Đầu dò điện hóa EMA European Medicines Agency Cơ quan Dược phẩm Châu Âu ESI Electrospray ionization Ion hóa phun điện EtOAc Ethyl acetate iv EtOH Ethanol FL Fluorescence Huỳnh quang GC Gas chromatography Sắc ký khí GC-MS Gas chromatography–mass Sắc ký khí ghép nối khối spectrometry phổ GLP Good Laboratory Practices Thực hành tốt phòng kiểm nghiệm thuốc GMP Good Manufacturing Practices Thực hành tốt sản xuất thuốc HMBC Heteronuclear multiple bond Phổ tương tác dị nhân qua correlation nhiều nối HPL Hypophyllanthin HPTLC High Performance Thin Layer Sắc ký lớp mỏng hiệu năng chromatography cao HQC High quality control Mẫu kiểm chứng nồng độ cao HSQC Heteronuclear Single Quantum Phổ tương tác dị nhân qua Correlation một lượng tử ICH The International Council for Hội nghị quốc tế về hòa hợp Harmonisation IR Infrared Hồng ngoại IS Internal standard Chuẩn nội ISO International Organization for Tổ chức quốc tế về tiêu Standardization chuẩn hóa J Coupling constant Hằng số ghép LC-MS/MS Liquid chromatography - Sắc ký lỏng ghép nối khối Tandem mass spectrometry phổ LLOQ Lower limit of quantitation Giới hạn định lượng dưới LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện v LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng LQC Low quality control Mẫu kiểm chứng nồng độ thấp m Multiplet Đỉnh đa MAE Microwave Assisted Extraction Chiết xuất với sự hỗ trợ của vi sóng MeOH Methanol MF Matrix factor Hệ số ảnh hưởng nền mẫu MQC Medium quality control Mẫu kiểm chứng nồng độ trung bình MRM Multiple Reaction Monitoring MS Mass Spectrum Phổ khối NCBI National Center for Trung tâm Thông tin Công Biotechnology Information nghệ sinh học Quốc gia NLĐC Nguyên liệu đối chiếu NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân NOESY Nuclear overhauser effect Phổ hiệu ứng hạt nhân spectrocopy overhauser NRT Niranthin NTT Nirtetralin PA Purify analysis Tinh khiết phân tích PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase PDA Photo Diode Array Dãy diod quang PLE Pressurized Liquid Extraction Chiết dưới áp suất cao PLT Phyllanthin ppm Parts per million Một phần triệu PTN Phòng thí nghiệm PTT Phyltetralin QC Quality Control Mẫu kiểm chứng vi Rs Resolution Độ phân giải RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard deviation Độ lệch chuẩn SFE Super-critical Fluid Extraction Chiết xuất bằng chất lỏng siêu tới hạn SKC Sắc ký cột SKD Sinh khả dụng SKĐ Sắc ký đồ SKĐC Sắc ký điều chế SKLM Sắc ký lớp mỏng t Triplet Đỉnh ba T1/2 Terminal half-life Nửa đời thải trừ TB Trung bình TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng TLTK Tài liệu tham khảo Tmax Time to maximum plasma Thời gian nồng độ trong concentration huyết tương đạt mức tối đa tR Retention time Thời gian lưu TT Thuốc thử ULOQ Upper limit of quantitation Giới hạn định lượng trên US-FDA United States - Food and drug Cơ quan Quản lý Thuốc và administration Thực phẩm Hoa Kỳ USP United States Pharmacopeia Dược điển Mỹ UV Ultraviolet Tử ngoại UV-Vis Ultraviolet - Visible Tử ngoại - Khả kiến VLC Vacuum liquid chromatography Sắc ký lỏng chân không vii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.

Thành phần hóa học trong Diệp hạ châu đắng. Tác dụng sinh học cây Diệp hạ châu đắng. Các công trình chiết xuất, phân lập các hợp chất lignan. Các phương pháp định lượng các hợp chất lignan.

So sánh hướng dẫn của US-FDA và EMA. Danh sách các trang thiết bị, vật tư sử dụng. Trình tự các cặp mồi dùng cho phản ứng PCR. Chương trình chạy PCR.

Điều kiện sắc ký điều chế ban đầu. Liều uống thuốc cho từng thỏ. Kết quả kiểm tra chất lượng dược liệu nghiên cứu. Kết quả search blast NCBI cặp mồi ITS1 – ITS4.

Kết quả khảo sát các dung môi chiết. Kết quả sắc ký cột của 3 loại cao. Kết quả phân lập sắc ký cột cao DCM. Kết quả chạy sắc ký cột phân đoạn IV.

Khảo sát điều kiện SKĐC phân đoạn VII. Khảo sát điều kiện SKĐC phân đoạn XII. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập bằng SKLM. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập bằng HPLC.

Kết quả kiểm tra độ tinh khiết các chất phân lập bằng DSC. So sánh các dữ liệu phổ NMR của chất PA2 và niranthin. So sánh các dữ liệu phổ NMR của chất PA3 và nirtetralin. Dữ liệu phổ NMR của chất PA4 và hypophyllanthin.

So sánh các dữ liệu phổ NMR của chất PA5 và phyltetralin. Dữ liệu phổ NMR của chất PA6 và phyllanthin. Kết quả thẩm định phương pháp xác định độ tinh khiết hypophyllanthin. Kết quả đánh giá liên PTN chất đối chiếu hypophyllanthin.

Xác định giá trị ấn định chất đối chiếu hypophyllanthin. Kết quả thẩm định phương pháp xác định độ tinh khiết niranthin. Kết quả đánh giá liên PTN chất đối chiếu niranthin. Xác định giá trị ấn định chất đối chiếu niranthin.

Kết quả thẩm định phương pháp xác định độ tinh khiết nirtetralin. Kết quả xác định độ tinh khiết nirtetralin. Khảo sát điều kiện sắc ký định lượng đồng thời 4 lignan. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống (n = 6).

Kết quả giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính. Kết quả đánh giá độ lặp lại và độ chính xác trung gian. Kết quả đánh giá độ đúng.

Kết quả khối lượng cắn và lượng hoạt chất trong cắn chiết từ Diệp hạ châu đắng với các dung môi khác nhau. Kết quả khối lượng cắn và lượng hoạt chất trong cắn Diệp hạ châu đắng theo thời gian ngâm. Kết quả khối lượng cắn và lượng hoạt chất trong cắn Diệp hạ châu đắng theo tỉ lệ dược liệu : dung môi. Kết quả lượng hoạt chất trong cắn Diệp hạ châu đắng theo số lần chiết.

Khối lượng cao thu được. Kết quả khảo sát dung môi chiết ở quy mô phòng thí nghiệm. Kết quả khảo sát dung môi chiết ở quy mô pilot. Kết quả mất khối lượng do làm khô của các mẫu cao.

Kết quả tro toàn phần của các mẫu cao. Kết quả giới hạn kim loại nặng của mẫu cao. Hàm lượng phyllanthin và hypophyllanthin trong mẫu cao. Kết quả giới hạn nhiễm khuẩn của các mẫu cao.

Kết quả kiểm nghiệm cao khô Diệp hạ châu đắng. Tóm tắt kết quả hàm lượng (%) 4 hợp chất lignan trong mẫu dược liệu. Tóm tắt kết quả hàm lượng (%) 4 hợp chất lignan trong các loại cao khô. Thế phân mảnh của các chất khảo sát.

Hiệu suất chiết của các chất chuẩn nội đã khảo sát. Kết quả khảo sát cột sắc ký. Kết quả khảo sát hệ pha động chứa methanol hoặc acetonitril. Kết quả so sánh loại đệm trong pha động.

Kết quả khảo sát nồng độ đệm amoni format. Kết quả khảo sát pH dung dịch đệm amoni format 5 mM. Thông số sắc ký của chất phân tích, chuẩn nội với nhiệt độ cột khảo sát. Thông số sắc ký của hỗn hợp chuẩn tương ứng với tốc độ dòng.

Thông số sắc ký của chất phân tích, chuẩn nội với thể tích tiêm khảo sát. Hiệu suất chiết các chất từ huyết tương thỏ với 2 dung môi tủa (n = 6). Kết quả khảo sát dung môi chiết (n = 6). Kết quả khảo sát thể tích dung môi chiết n-hexan (n = 6).

Kết quả khảo sát số lần chiết (n = 6). Nồng độ của các hoạt chất trong huyết tương thỏ. Tóm tắt kết quả thẩm định phương pháp. Các thông số dược động học trung bình của các chất phân tích.

116 x DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ Trang Hình 1. Cây Diệp hạ châu đắng Phyllanthus amarus Schum., Euphorbiacea (trái) và hoa (phải) Diệp hạ châu đắng .