Luận án TS: Nghiên cứu tách chiết, phân tích ADN tế bào phôi thai chẩn đoán trước sinh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Triệu Tiến Sang NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT, PHÂN TÍCH ADN VÀ TẾ BÀO PHÔI THAI TỰ DO TRONG MÁU NGOẠI VI MẸ ĐỂ CHẨN ĐOÁN TRƢỚC SINH LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2015 1 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Triệu Tiến Sang NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT, PHÂN TÍCH ADN VÀ TẾ BÀO PHÔI THAI TỰ DO TRONG MÁU NGOẠI VI MẸ ĐỂ CHẨN ĐOÁN TRƢỚC SINH Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62420121 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1.TS Trần Văn Khoa 2.TS Đinh Đoàn Long Hà Nội, 2015 2 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân, đƣợc thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn khoa học của PGS. Trần Văn Khoa và PGS. Đinh Đoàn Long. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình. Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Nghiên cứu sinh Triệu Tiến Sang 3 LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành và sâu sắc tới PGS. Trần Văn Khoa – Chủ nhiệm Bộ môn Sinh học và Di truyền y học – Học viện Quân y, Trƣởng phòng Công nghệ Gen và Di truyền tế bào – Trung tâm nghiên cứu Sinh Y dƣợc – Học viện Quân y và PGS. Đinh Đoàn Long – Chủ nhiệm Bộ môn Y dƣợc học cơ sở , Phó Chủ nhiệm Khoa Y Dƣợc - Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình hƣớng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận án tiến sĩ.

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. Nguyễn Thị Hồng Vân – Chủ nhiệm Bộ môn Di truyền học, các thầy cô giáo Bộ môn Di truyền học và Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã chỉ bảo tận tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới GS. Hoàng Văn Lƣơng – Phó giám đốc Học viện Quân y, Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Sinh y Dƣợc – HVQY; PGS.TS Nguyễn Duy Bắc, Phó Phòng Công nghệ Gen và Di truyền tế bào và các đồng chí, đồng nghiệp tại Bộ môn Sinh học và Di truyền y học; cùng các đồng chí tại Phòng Công nghệ gen và Di truyền tế bào – Trung tâm nghiên cứu Sinh Y Dƣợc học – Học viện Quân y đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn Trung tâm Nghiên cứu gen và protein – Đại học Y Hà Nội, Phòng Xét nghiệm Di truyền – Bệnh Viện Từ Dũ và Trung tâm Nghiên cứu Sinh Y Dƣợc – Học viện Quân y đã cung cấp mẫu phục vụ cho các nghiên cứu của luận án. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và tất cả những ngƣời thân, bạn bè đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu vừa qua. Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Nghiên cứu sinh Triệu Tiến Sang 4 CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa Tiếng Việt A Adenine Adenine ADN Deoxyribonucleic Acid Acid Deoxyribonucleic AF Amniotic Fluid Dịch ối AFP Alpha-fetoprotein Alpha-fetoprotein AIHW Australian Institute of Health and Viện sức khỏe và phúc lợi Úc Welfare ATP Adenosine Triphosphate Adenosine Triphosphate Bp Base pairs Cặp bazơ C Cytosine Cytosine CAH Congenital Adrenal Hyperplasia Tăng sản thƣợng thận bẩm sinh CVS Chorionic villous sampling Lấy mẫu gai rau dNTPs Deoxyribonucleotide Deoxyribonucleotide Triphosphate Triphosphate DTBS Dị tật bẩm sinh EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid Acid FACS Fluorescence-activated cell Phân loại tế bào bằng hoạt hóa sorting huỳnh quang FISH Fluorescence in-situ hybridization Lai tại chỗ huỳnh quang fNRBCs Fetal nucleated red blood cells Tế bào hồng cầu có nhân của phôi thai G Guanine Guanine HCĐ Down syndrome Hội chứng Down Kb Kilo base Kilo base 5 KSSG Khoảng sáng sau gáy MACS Magnetic activated cell sorting Phân loại tế bào hoạt hóa từ tính NST Nhiễm sắc thể PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi nhờ polymerase PUBS Percutaneous umbilical cord Lấy mẫu máu cuống rốn qua da blood sampling QF-PCR Quantitative fluorescence - Phản ứng chuỗi định lƣợng Polymerase Chain Reaction huỳnh quang STR Short Tandem Repeat Lặp lại liên tiếp đoạn ngắn T Thymine Thymine Taq – Thermus aquaticus polymerase polymerase TBE Tris - Boric – EDTA Tris - Boric – EDTA TOP Termination of pregnancy Đình chỉ thai UV Ultra Violet Tia cực tím β hCG Beta_human chronic Beta_human chronic gonadotropin gonadotropin 6 DANH MỤC BẢNG STT TRANG 1 Bảng 1. Thống kê so sánh 4 sản phẩm thƣơng mại của kỹ thuật 33 NIPT 2 Bảng 1.

Các Kít sử dụng kỹ thuật NIPT ứng dụng tại Mỹ 34 3 Bảng 2. Thành phần hóa chất của bộ QIAamp ADN blood Mini 49 Kit 4 Bảng 2. Trình tự và kích thƣớc sản phẩm khuếch đại gen SRY 50 và GAPDH 5 Bảng 2. Thành phần của phản ứng PCR vòng 1 và vòng 2 51 6 Bảng 2.

Chu trình nhiệt của phản ứng nhân gen mồi ngoài và 51 mồi trong gen SRY và chu trình nhiệt nhân gen GAPDH 7 Bảng 2. Trình tự mồi và đầu dò của phản ứng định lƣợng huỳnh 52 quang gen DYS14 và GAPDH 8 Bảng 2. Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime-PCR 53 9 Bảng 2. Công thức và ứng dụng của các chất gắn trên bề mặt 54 hạt từ tính 10 Bảng 2.

Các locus STR trên các NST 13, 18, 21 và NST X, Y 57 11 Bảng 2. Thành phần và thể tích của phản ứng QF-PCR 58 12 Bảng 2. Chu trình nhiệt của phản ứng QF-PCR 58 13 Bảng 2. Các thành phần cho 1 mẫu điện di 59 14 Bảng 2.

Chu trình nhiệt biến tính sản phẩm PCR cho điện di 59 mao quản 15 Bảng 2. Phân tích tỷ lệ các peak huỳnh quang STR 61 16 Bảng 2. Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật Nested PCR 62 hoặc Realtime PCR 17 Bảng 3. Nồng độ ADN (ng/µl) của phƣơng pháp tách bằng 63 nhiệt và phƣơng pháp tách bằng bộ Kít Qiagen 18 Bảng 3.

Kết quả số bản copy gen DYS14 (A: copy/ml) và nồng 71 độ gen DYS14/GAPDH (B: %) ở các tuần 6 đến 12 của thai kỳ của các trƣờng hợp thai nam 19 Bảng 3. Kết quả số bản copy gen GAPDH (A: copy/ml) ở các 72 tuần 6 đến 12 của thai kỳ của các trƣờng hợp thai nữ 20 Bảng 3. So sánh kết quả của kỹ thuật Nested PCR, Realtime 75 PCR với siêu âm ở tuần thứ 16/ sau sinh (A) 21 Bảng 3. Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật Nested PCR và 76 7 Realtime-PCR ở 6 tuần tuổi thai 22 Bảng 3.

Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật Nested PCR và 76 Realtime-PCR ở 7 tuần tuổi thai 23 Bảng 3. Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật Nested PCR và 77 Realtime-PCR ở tuổi thai >8 tuần. Độ nhạy và độ đặc hiệu của 2 kỹ thuật Realtime PCR 77 và Nested PCR ở các tuần tuổi thai 25 Bảng 3. Kết quả nhân gen SRY (trƣớc sinh: A) và kiểm chứng 85 sau sinh (B) của 189 mẫu nghiên cứu tuổi thai từ 7+6 đến 9+2 26 Bảng 3.

Kết quả nồng độ ADN biến thiên sau sinh 87 27 Bàng 3. Nồng độ ADN phôi thai tự do trong huyết tƣơng mẹ 98 mang thai nam bình thƣờng 28 Bảng 3. Nồng độ ADN phôi thai tự do trong huyết tƣơng mẹ 99 mang thai nam bất thƣờng 29 Bảng 3. Kết quả sàng lọc bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh 107 30 Bảng 3.

Kết quả sàng lọc bệnh loạn dƣỡng cơ Duchenne 110 31 Bảng 3. Chu trình nhiệt của phản ứng nhân gen RhD 111 32 Bảng 3. Kết quả chẩn đoán nhóm máu Rh của thai nhi ở tuần 112 thứ 8 33 Bảng 3. Kết quả thử nghiệm trên các tế bào phôi thai tự do 116 8 DANH MỤC CÁC HÌNH STT TRANG 1 Hình1.1: Các bƣớc chình của kỹ thuật FISH 24 2 Hình 1.2: Nguyên tắc của phản ứng Nested PCR (PCR lồng) 25 3 Hình 1.

Phƣơng pháp Real-time PCR với mẫu dò TaqMan 26 4 Hình 1. Tóm tắt cơ chế hoạt động của Taqman probe trong Realtime- 27 PCR 5 Hình 2. Sơ đồ nghiên cứu 48 6 Hình 2. Trình tự đoạn gen DYS14 53 7 Hình 2.

Trình tự đoạn gen GAPDH 53 8 Hình 2. Các chất gắn trên bề mặt ha ̣t tƣ̀ tính 54 9 Hình 2. Phân tích kết quả QF-PCR bình thƣờng 59 10 Hình 2. Phân tích tính kết quả tỷ lệ giữa các alen 60 11 Hình 2.

Ảnh phân tích kết quả QF-PCR locus bị Trisomy 61 12 Hình 3. Ảnh điện di của gen SRY và GAPDH của các mẫu nghiên cứu 65 13 Hình 3. Ảnh điện di của gen SRY và GAPDH của các mẫu nghiên cứu 66 từ 811 - 825 14 Hình 3. Ảnh kết quả điện di của gen SRY và GAPDH của các mẫu 67 nghiên cứu từ 826 - 840 15 Hình 3.

Phân tích đƣờng chuẩn của gen DYS14 và gen GAPDH 70 16 Hình 3. Ảnh điện di các mẫu ở tuổi thai 6 tuần tuổi từ mẫu 269 đến 78 mẫu 301 17 Hình 3. Ảnh nhân gen GAPDH ở tuổi thiai 6 tuần tuổi từ các mẫu 269 78 đến 297 18 Hình 3. Ảnh điện di các mẫu ở tuổi thai 7 tuần tuổi từ mẫu 269 đến 79 mẫu 321 19 Hình 3.

Ảnh điện di các mẫu ở tuổi thai 8 tuần tuổi từ mẫu 269 đến 80 mẫu 321 9 24 Hình 3. Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự do của trƣờng hợp 269 81 25 Hình 3. Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự do của trƣờng hợp 277 82 26 Hình 3. Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự do của trƣờng hợp 296 83 27 Hình 3.

Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự do của trƣờng hợp 551 84 28 Hình 3. Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN phôi thai tự do sau khi sinh 88 29 Hình 3. Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu QF64 90 (tƣơng ứng mẫu nghiên cứu BT05) nam bình thƣờng 30 Hình 3. Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu QF 61 92 (tƣơng ứng với mẫu DT 02) nam mang hội chứng Down 31 Hình 3.

Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR điện di mao 93 quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu DT02 với các cặp mồi extra Marker 21 32 Hình 3. Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu QF56 94 (tƣơng ứng với mẫu DT03) mang hội chứng Klinefelter 33 Hình 3. Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu DT03 95 (QF56) với các mồi extra marker trên locus X, Y 34 Hình 3. Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu DT08 96 mang hội chứng Edward 35 Hình 3.